[自然科学]高效液相色谱hlpc

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1、高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,HPLC)中南大学湘雅医学院医学检验系徐克前一 基本原理(一)定义HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同,进行连续的、无数次的交换和分配而达到分离的过程。组成:固定相—柱内填料流动相—洗脱剂(二)固定相(stationaryphase)和流动相(mobilephase)(1)化学键合相硅胶化学官能团键合到硅胶表面OHOH

2、

3、硅胶(SiO2•nH2O)––Si–O–Si––

4、

5、键合相反应R1

6、

7、

8、

9、–S

10、i–OH+X–Si–R→–Si–O–Si–R+HX

11、

12、

13、

14、R2硅胶有机硅烷键合相X:Cl、CH3O、C2H5O等R:烷C8(C8H17)、C10(C10H21)、C18(C18H37)等R1R2:Z、CH3等(2)十八烷基硅烷键合硅胶填充料(octadecylsilyl,ODS)—万能柱即C18柱或ODS柱主要用于反相HPLC中,适用于各种类型的生物分子(3)短链烷基键合物短链烷基(c3、c4等)+大孔硅胶键合物适用于氨基酸、小肽等生物小分子(4)键合到基质上的官能团性质反相柱:填料是非极性的,官能团为烷烃

15、,如C18、C8、C4等正相柱:填料是非极性的,官能团为-CN、-NH2等离子交换键合相:阳离子官能团:-SO3H、-COOH等阴离子官能团-NH2、-R4N+等2、流动相(mobilephase)流动相选择原则:1.样品易污,且溶解度尽可能大 2.化学性质稳定,不损坏柱 3.不妨碍检测器检测分析 4.粘度低,流动性好 5.易于从中回收样品 6.无毒或低毒,易于操作 7.易于制成高纯度,即色谱纯 8.废液易处理,不污染环境反相色谱常用流动相及冲洗强度H2O<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃最常用组成

16、:甲醇/H2O、乙腈/H2O洗脱顺序:极性物先洗脱下来正相色谱常用流动相及冲洗强度正乙烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇二、分离模式正相HPLC反相HPLC离子交换HPLC凝胶HPLC亲和HPLC(一)正相HPLC(normalphaseHPLC,NP-HPLC)固定相:极性吸附剂(或极性键合          相),如硅胶、Al3O2流动相:非极性或弱极性溶剂,如己烷、庚烷等洗脱顺序:非极性、弱极性、极性应用:石油化工产品、染料、农药、医药、有机酸、有机碱等(二)反相HPLC(reversephaseHPLC,R

17、P-HPLC)固定相:非极性物质,如C18(ODS)、C10、C8、C6、C4、C2流动相:极性溶剂,如甲醇/H2O、乙腈/H2O等洗脱顺序:极性、弱极性、非极性应用:蛋白质、多肽等(三)离子交换HPLC(ion-exchangeHPLC,IE-HPLC)原理:用离子交换剂作固定相,根据不同组分在一定pH下,组分电荷性质和数量不同而分离的技术分类:阳离子交换树脂:合酸性基团:阴离子交换树脂:磺酸基、磷酸基等合碱性基团:季胺基、叔胺基等应用:核酸、蛋白质、氨基酸等(四)凝胶HPLC(gelHPLC,G-HPL

18、C)原理:基于分子大小和形状的差异进行分析的技术固定相:交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶流动相:水、乙醇、丙酮等应用:核酸、蛋白质、酶、多糖等(五)亲和HPLC(affinityHPLC,AF-HPLC)原理:利用生物大分子间专一的亲和力 进行分离的技术固定相:基质(琼脂糖凝胶等)交联配基(亲和性)应用:酶、抗体、抗原、受体等三、HPLC仪器HPLC仪一般由输液系统、进样系统、色谱柱、检测器、记录和数据处理系统及计算机等几部分组成(一)输液系统:贮液及脱气装置梯度洗脱装置高压输液泵梯度洗脱装置高压输液泵(二)进样

19、系统:(三)柱系统:(四)检测器:与泵、柱组成HPLC的三大关键部件1.紫外吸收检测器2.荧光检测器4.示差折光检测器表.HLPC常用检测器检测器原理检测下限(g/ml)检测范围紫外检测器具有紫外吸收性质10-7荧光检测器具有荧光物质10-14电化学检测器具有电解活性物质10-12示差折光检测器与流动相折光率不同10-7糖类等蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、激素等多环芳烃、氨基酸、维生素等食品、环境、生化、医学等(五)不同HPLC产品介绍:高效液相色谱仪器(1)高效液相色谱仪器(2)高效液相色谱仪器(3)高效液

20、相色谱仪器(4)四、定性和定量定性分析1.保留值定性:比较未知峰与标准物的保留     值2.收集未知峰洗脱液定性:物理分析,化学分析,生物学 分析3.联机定性:液质联用(HCLC-MS)液红联用(HCLC-IR)定量分析分析检测物质的量(或浓度)与检测器的响应值(峰面积或峰高)呈正比1.标准曲线法:也称外标法或直接比较法。用标准品等体积直接进样,得标准曲线,再用待测样品的峰面积(或峰高)与其对照2.内标法:选择

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