《基因克隆的载体》ppt课件

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1、基因克隆的载体载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）。4、有适合的标记，易于选择。5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。6、从安全角度考虑，要求载

2、体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。载体功能克隆载体:克隆一个基因或DNA片断表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中载体来源：质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体真核细胞克隆载体质粒*受体细胞结构插入片断举例E.coli环状〈8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，Λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVB

3、AC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载

4、体的种类和特征第一节质粒（plasmid）载体质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106~108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。质粒载体克隆的质粒载体允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体允许外源D

5、NA的插入、储存和表达。一、质粒的生物学特性：1、质粒DNA的构型：SC型共价闭合环形DNA（cccDNA）OC型开环DNA（ocDNA）L型线性DNA（cDNA）2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：106~108D3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点LOCSC4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等5、质粒DNA的类型：接合型和非接合型；含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌素抗性基因的R质粒；F因子和F`因子等。按接合转移

6、功能分类主要基因按抗性记号分类非接合型质粒自主复制基因，长生大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子)接合型质粒自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段F质粒（F因子）自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子)自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Ent质粒6、质粒DNA的复制类型：低拷贝的质粒（1～3）：严紧型复制控制的质粒（接合型）高拷贝的质粒（10~60）：松弛型复制控制的质粒（非接合型）7、质粒的不亲合性在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种

7、不同的。也称为质粒的不相容性。是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。（二）、质粒DNA的分离与纯化1、氯化铯密度梯度离心法；2、碱变性法；3、微量碱变性法。1.氯化铯密度梯度离心法1、质粒DNA占总DNA的1%～2%；2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形

8、成的EB-DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。流程：首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链的碱基中去。