b_01 苯酚生物降解菌的筛选

《b_01 苯酚生物降解菌的筛选》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、CentralLaboratoryofBiology苯酚生物降解菌的筛选目的要求1.掌握微生物分离纯化的基本操作；2.掌握用选择性培养基从土壤中分离苯酚生物降解菌的原理和方法。基本原理苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。因此采用一定的方式降解苯酚，对保护人类健康、消除环境污染意义重大。在提倡绿色环保的大前提下，采用生物降解的途径势在必行。微生物对污染物质的代谢、转化及降解作用，是当今环境污染研究中最活跃的领域之一。自然界中

2、能降解烃类的微生物有几百种，多为细菌、酵母菌和真菌，降解是由他们所产生的酶和酶系统完成的，一般直链化合物比支链化合物、饱和化合物比非饱和化合物、脂肪烃比芳香烃容易被较多种类的微生物降解和同化。直链烃的降解是末端甲基被氧化形成醇、醛后再生成脂肪酸，由脂肪酸形成醋酸，最后氧化成二氧化碳和水，微生物对单环芳烃及其衍生物的降解与直链烃类似，能降解苯和酚的微生物种类很多，细菌中的很多属，放线菌等。基本原理苯酚是芳香烃化合物。苯酚是常用的表面消毒剂之一，它们是TCA（三羧酸）循环的抑制剂。现已发现某些假单胞菌、争

3、论产碱菌、真养产碱菌含有芳香烃的降解质粒，将其降解生成琥珀酸、草酰乙酸、乙酰CoA，进入TCA循环。在苯酚浓度梯度培养基平板高含药区上分离出的菌落，对苯酚具有较好的耐受性，可能具有分解酚菌的能力；然后将其在以苯酚为唯一碳源的培养基里进行摇床培养，淘汰掉不能利用苯酚的菌株，可筛选到苯酚降解菌；再用不同浓度的苯酚药物培养基分离，可筛选出耐受能力好，降解程度高的苯酚降解菌。实验用品1．材料：（样品）　实验土样采自校园肥沃土。2．器材和仪器：试管、250ml三角烧瓶、1mL吸管、吸耳球、无菌涂棒、量筒、天平、

4、灭菌锅、培养箱、酒精灯、接种环、棉花、棉线、牛皮纸。3．试剂：牛肉膏蛋白胨苯酚K2HPO4KH2PO4MgSO4FeSO4琼脂4.培养基2.以苯酚为单碳源的菌株的筛选1）单碳源培养基配制：按培养基D的配方，用250mL三角瓶，每瓶装50mL，制成以苯酚为单碳源的液体摇瓶；2）苯酚的浓度设定：苯酚的浓度分别按0.2g/L，0.4g/L，0.6g/L，0.8g/L，1.0g/L，1.2g/L六个浓度梯度配制；3）平行样：每菌株、每药物浓度各配置平行样两瓶；4）灭菌：121℃，20min；5）接种：将初选的

5、苯酚耐受性菌株，分别用少许无菌水稀释，接种于对应摇瓶中；6）培养：八层纱布盖口，回旋式摇床，30℃，100转/min培养2天；7）检测：用分光光度计测定OD值，以空白培养基作对照，检测各摇瓶菌体浓度；8）筛选：淘汰掉不能利用苯酚为碳源的菌株。菌体浓度高的为生长较好者，即能以苯酚为单碳源的菌株，可进行下一步实验。3.高耐受性苯酚降解菌的筛选1）药物培养基平板的配制：按不同浓度（0.2g/L，0.4g/L，0.6g/L，0.8g/L，1.0g/L，1.2g/L）苯酚配置药物培养基平板；2）灭菌、倒平板：1

6、21℃，灭菌20min，倒平板，各菌株、各浓度配置两个；3）菌悬液制备：将初选的培养液作适度稀释，或将保藏的经单碳源实验的菌株用无菌水制成菌悬液；4）涂平板：用1mL移液管分别从各菌悬液试管中取菌悬液0.2mL涂布于药物培养基平板上，每一试管菌悬液涂布一组不同浓度的苯酚药物培养基平板，每一浓度设平板两个，六组共计12个；5）培养：恒温培养箱30℃培养1-2天；6）筛选：观察、记录并挑选高浓度药物培养基平板上生长旺盛的菌落，此即高耐受性苯酚降解菌，接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面；7）保藏：编号，4℃冰箱保

7、藏。实验结果平板编号12345678药物浓度（g/L）0.10.10.10.10.10.10.10.1高药区单菌落数1．苯酚耐受菌株的初选结果实验结果药物浓度（g/L）0.20.40.60.81.01.2菌种编号123452.以苯酚为单碳源的菌株的筛选结果（生长情况OD值）药品浓度（g/L）0.20.40.60.81.01.2菌株号123453.高耐受性苯酚降解菌的筛选结果（菌落数）实验结果注意事项1.各种培养基的配制应严格按配方的要求完成，尤其是苯酚的称量和pH；2.涂布梯度平板的菌悬液只作适度稀释

8、，菌浓度不必过低；3.涂布平板的菌悬液不要过多或过少，0.2mL为宜；4.梯度平板上挑取菌落时，要挑取单菌落；5.单碳源实验的培养基和培养条件一定要严格把握。实验报告1.用三线表记录实验步骤1-3所得的实验结果。2.实验结果分析。3.菌体、菌落形态的描述。生物学实验教学中心