《蛋白质研究方法》ppt课件

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1、基础医学院生物化学与分子生物学教研室易发平硕士生学位课程：蛋白质组学-5候选蛋白质的验证个人简介血统：正宗重庆人——直爽、耿直普通话：渝普话——多多包涵爱好：篮球——切磋投篮邮箱：fazicq@163.com蛋白质酶解肽的混合物PMF搜索引擎Searchengine数据库搜索结果验证蛋白质组研究路线RNAi实验流程免疫荧光法授课内容4流式细胞术免疫印迹法免疫组化法1231候选蛋白质的验证一1蛋白质与生物大分子相互的研究二下一讲免疫印迹法blotting实验技术印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的

2、探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。免疫印迹法SouthernBlottingNorthernblottingWesternBlottingEasternBlottingSouthwesternblottingfar-westernblotting2D电泳分离蛋白质，然后转膜，特异的探针去检测SDS-PAGE分离蛋白,转膜,尿素去除SDS,蛋白复性,特定DNA探针检测。与目标蛋白结

3、合的非抗体蛋白质检测检测对象是DNA检测对象是RNA检测对象是特定蛋白质检测蛋白质翻译后修饰检测DNA和蛋白质相互作用检测蛋白质之间的相互作用碱基互补配对对象已知确定对象未知免疫印迹法WesternBlotting实验技术之基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。抗原抗体之间特异的免疫反应。免疫印迹法WesternBlotting实验技术之一般流程转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹法成功的要素科学的对照免疫印迹法Western

4、Blotting实验技术之流程详解转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（1）免疫印迹法之蛋白样品的制备WesternBlotting实验技术通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白1.水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。盐析沉淀出的蛋白质一般保持着天然构象。常用的中性盐是硫酸铵。细胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg

5、/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0免疫印迹法——蛋白样品的制备2.低温有机溶剂提取法蛋白质处在一定量的有机溶剂中，分子间极性基团的静电引力增强，水化作用降低，蛋白质聚集而沉淀。对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。该法沉淀蛋白质的选择性较高，不需脱盐。免疫印迹法——蛋白样品的制备3.水溶性多聚物沉淀法聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（DEX）等溶于水中，蛋白质的极性基团与多聚物分子中的氧或氢氧根结合，形成二者的复合体，从溶液中沉淀析出。改变多聚物的浓度可分段沉

6、淀出不同的蛋白质。4.通过层析或电洗脱法、色谱等制备目的蛋白2-DE分离蛋白免疫印迹法——蛋白样品的制备病毒细胞叶绿体细胞膜protein2-DE鉴定验证免疫印迹法目的蛋白质的量较多，至少占总蛋白量的1%，常为5%-9%，使纯化易于进行。可利用融合蛋白质的特性进行纯化。利用标示物（tag）的特性，用亲合层析柱，可快速分离纯化融合蛋白质，最后切除tag即可。很多表达载体已带有tag的DNA序列。重组蛋白的特点免疫印迹法包含体的形成。主要出现在大肠杆菌等原核生物中，溶解度很小的蛋白都进入包含体中，包含体中的蛋白质主要是外来性的重组

7、蛋白。离心的方法先收集包含体，再从中分离蛋白。分泌蛋白质的生成。目的蛋白前加入信号肽序列，可使真核细胞内表达的蛋白分泌到培养基中，因其中的蛋白质种类较少而使目的蛋白的分离纯化得以简化。大肠杆菌等有细胞壁的细胞可分泌至周质中，收集细胞后，改变渗透压，同时加入少量溶菌酶破坏细胞壁，提取周质后，纯化目的蛋白。重组蛋白的特点免疫印迹法WesternBlotting实验技术之蛋白样品的定量生物化学所学的方法都可以。凯氏定氮法、双缩脲法、福林-酚法和紫外吸收法。免疫印迹法—蛋白样品的定量紫外吸收法：蛋白质在280nm左右有吸收高峰（因色氨

8、酸和酪氨酸的吸收），不同的蛋白，其中色氨酸和酪氨酸的含量各异，因此A280值不同。Bradford法考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅