《基因工程中的酶》ppt课件

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1、第三节基因工程中的酶学关键词：了解各种酶在基因工程中的作用掌握限制性内切酶和连接酶的基本特性逆转录酶在基因工程中参与了哪些反应？12重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶I反转录酶多聚核苷酸激酶末端转移酶碱性磷酸酶识别特异序列，切割DNA催化DNA中相邻的5‘磷酸基和3’羟基末端之间形成磷酸二酯键，是DNA切口封合或是DNA片段连接①合成双链cDNA的第二条链②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3’末端①合成cDNA②代替DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析催化多聚

2、核苷酸5’羟基末端磷酸化，或标记探针在3’羟基末端进行同质多聚物加尾切除末端磷酸基3第一限制性核酸内切酶这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。4一、限制性内切酶概念的提出寄主控制的限制（restriction）与修饰(modification)现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。

3、5为什么生物体产生的限制酶，不会损失自身的DNA呢？？？6R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶7E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶以λ(k)噬菌体侵染E.coliB为例8限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制（Restriction）9细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序

4、列在第二个C上C5位置上引入甲基1011R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解12切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。13I型限制性内切酶目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类限制性内切酶不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。基因工程的工具酶切割位点不在识别位点，一般离识别位点25bp～27bp，对分子克隆操作亦无实用意义14首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌

5、中分离出来。（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。II类限制性内切酶分离的第一个酶是HindⅡ15（2）切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。识别位点处。16EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端（3）平末端（bluntend）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心,这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。17两条链上的断裂位置是交错地，但又是围绕着一个对称结构中心，这样形成的

6、断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段（4）粘性末端（stickyends，cohensiveends）18含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：①5’端凸出（如EcoRI切点）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’3’-5’-19CTGCAG②3’端凸出（如PstI切点）GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAGGACGTC5’-3’-20与DNA结合的限制性内切酶BamH1的结构。限制性内切酶识别双链DNA序列5‘-GGATC

7、C-3’，并在两个GG残基之间切开磷酸二酯键。这个切割形成带有两个有5‘粘性末端的DNA片段。这种蛋白质是有相同的亚基组成的二聚体。21①连接便利（5）粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。2223③补平成平齐末端②5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。24同位酶是具有相同的识别序列，但酶切位点不同的酶如SmaI和XmaI的识

8、别序列为5’-CCCGGG-3’,但酶切位点不同。SmaI5’-C↓CCGGG-3’,XmaI5’-CCC↓GGG-3’,同位酶25同裂酶（Isoschizomers）有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端Example:限制酶HpaⅡ