《基因工程相关技术》ppt课件

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1、第五章:基因工程基本技术主讲教师:杨应斌答疑电话:13667665876Email:yingbin@vip.sina.com基因工程概论酶切目的基因载体M琼脂糖凝胶回收技术目的基因线性载体连接反应感受态大肠杆菌转化电泳技术筛选鉴定重组载体引言本章内容核酸的琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶DNA片段的回收感受态大肠杆菌的制备核酸琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳原理与操作核酸的琼脂糖凝胶电泳—注意事项准备干净的配胶板和电泳槽选择电泳方法适合的电泳缓冲液电泳的合适电压和温度DNA样品的纯度和状态DNA的上样Marker的选择凝胶的染色和观察正确选择凝胶浓度准备干净的配胶板和电泳槽注意:D

2、NA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象选择电泳方法１．一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；２．如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；３．用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。电泳缓冲液配制正确选择凝胶浓度浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大

3、片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mMNaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的

4、DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。DNA的上样Marker的选择DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。凝胶的染色和观察实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。本章内容核酸的琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶DNA片段的回收感受态大肠杆菌的制备聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE原理Acr(单体丙烯酰胺)Bis(交联剂)TEMED(加速剂)AP(催化剂过硫酸铵)以此凝胶为支持物的

5、电泳称PAGE。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）PAGE注意事项（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。（2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。（3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。（4）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。本章内容核酸的琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶DNA片段的回收感受态大肠杆菌的制备基因组DNA的提取与纯化RNA的提取与cDNA合成琼脂糖凝胶DNA片段的回收琼脂糖凝胶DNA片段的回收操作流程切胶融胶电转电泳离心硝酸纤维膜洗脱目的基因线性

6、载体本章内容核酸的琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶DNA片段的回收感受态大肠杆菌的制备基因组DNA的提取与纯化RNA的提取与cDNA合成感受态大肠杆菌的制备大肠杆菌Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+经典氯化钙法制备感受态大肠杆菌的原理感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，我们把处于易接收外源ＤＮＡ状态的大肠杆菌，称为感受态大肠植菌．DNA分子DNA分子Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+

7、Ca2+Ca2+Ca2+经典氯化钙法制备感受态大肠杆菌的原理感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，我们把处于易接收外源ＤＮＡ状态的大肠杆菌，称为感受态大肠植菌．DNA分子感受态大肠杆菌Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+DNA分子钙磷复合物用天