《基因工程程序课时》ppt课件

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1、1.2基因工程的基本操作程序一、基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取。2．______________的构建。3．将目的基因导入_________。4．目的基因的检测与鉴定。基因表达载体受体细胞预习提纲:一、为什么要有“目的基因的获取”这一步？二、为什么要有“表达载体的构建”这一步？有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性单独的DNA片段──目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。三、为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步？四、为什么要有“目的基因的检

2、测与鉴定”这一步？含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。2.基因文库的构建方法①鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)(一)从基因文库中获取目的基因②反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA杂交双链(单链

3、RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶核酸酶H2.基因文库的构建方法DNA聚合酶双链DNA(目的基因)③根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成2.基因文库的构建方法(二)利用PCR技术扩增目的基因1.概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术2.原理：________

4、__4.方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）5.结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二)利用PCR技术扩增目的基因3.过程:(变性、退火、延伸)条件：四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的两条链为模板温度控制PCR技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。点点生物学教学寻根问底——（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列

5、已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因

6、等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因

7、能够表达和发挥作用。a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因编码区上游编码区下游RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶结合位点编码蛋白质调控调控原核细胞真核细胞真核细胞1.启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录.2.终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾部，起终止转录的作用.1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。——核心3.将切下的目的基因片段插入