限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析和应用

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1、PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓限制性核酸内切酶切割原理、方法、结果分析及应用课堂内容回顾：1、定义：1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。2、分类：（根据酶的基因、蛋白质结果、依赖的辅助因子及DNA裂解的特异性，将限制性内切酶分为三种类型）Ⅰ型酶：具有DNA修饰的作用在非特异位点处切割DNA。Ⅱ型酶：是最重要的工具酶‘能在DNA分子内部的特异位点识别和切割DNA双链，所以通常所说的限制性内切酶就指这一类酶。Ⅲ型

2、酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，其切割位点很难预测{Ⅰ型酶：具有DNA修饰的作用在非特异位点处切割DNA。Ⅱ型酶：是最重要的工具酶‘能在DNA分子内部的特异位点识别和切割DNA双链，所以通常所说的限制性内切酶就指这一类酶。Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，其切割位点很难预测。3、命名：规则：第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名第二、三个字母（小写）：该细胞的种名第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中不同限制性内切酶的编号例如：EcoRⅠ、HindⅢ等等限制性核酸内切酶切割原理1、Ⅰ类和Ⅲ类酶：

3、在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。2、Ⅱ类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列，产生5'或3'黏性末端（也有一些产生平端或钝端）几种限制性内切酶的切

4、割位点例如：3、同工异源酶：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。如：BamHⅠ和BstⅠ，XhoⅠ和PaeR7等可以相互代替使用。4、同尾酶：识别序列不同，但产生相同末端的限制性内切酶。如：BamHⅠ和Sau3AⅠ等由此产生的DNA片段可借黏性末端相互连接，操作是具有更大的灵活性。通过使用(15种)限制性内切酶酶切重组质粒，说明限制性内切酶的应用和限制性内切酶酶切图谱分析的方法o方法：1.质粒的构建采用聚合酶链反应chainreaction，PCR)方法扩增出MLCKcDNA片段，插入质粒pBKrsv中，构建

5、成pBKrsv-MLCK重组质粒2.酶切、构建、片段的纯化和连接按Maniatis等方法进行。3.重组质粒的转化转化采用“热休克”法。4.重组质粒的提取挑取阳性克隆，在LB培养基中培养，采用碱裂解法提取重组质粒。5.定量取5μLDNA溶液用4.5μl去离子水稀释，用紫外分光光度计比色，读取AZ60和AZ80吸光度值，计算出AZ60/AZ80比值，按下列公式计算质粒DNA浓度,本实验中质粒DNA浓度为1.0g/L。质粒DNA浓度(g/L)=AZ60X稀释度/Z0=AZ60X56.重组质粒的限制性核酸内切酶酶切取

6、0.5ml离心管15只，分别加入质粒2μl(2μg)，依次加入限制性内切酶AccI、ApalI、AvaH、BglI、BglH、NcoI、OxanI、PuvH、PpUMI、SalI、SspI、SstI、XbaI、Hind皿、EcoRI各0.5微升及相应的NEBuffer2μL、BSAμL、去离子水13.5μL、混匀、点动离心，37℃水浴孵育2小时。7、配置1.5％的琼脂糖凝胶称取琼脂糖0.6g,加入1XTAE缓冲液40ml置微波炉中,中火120s，熔化后冷却至60℃，加入3μL10g/l溴化乙锭，混匀，倒入插好

7、梳子的模具中，凝固后放入电泳槽中。电泳槽中加入1×TAE缓冲液。8、电泳取酶切产物8μl与DNA上样缓冲液2μl混匀，进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可观察到橘红色DNA条带，结果如图Loremipsumdolorsitamet,consecteturadipisicingelit.结果重组质粒pBKrsv-MLCK全长7378bp，通过DNAstar软件分析获得各酶酶切位点的信息，选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点，计算酶切后片段大小的理论值经各种限制性内切酶酶切后，

8、获得不同大小的片段，经电泳分析与理论设计完全一致。结果分析限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向(orientation)l在选择限制性内切酶时,应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点,这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要。在进行限制性内切酶实验时首先应进行DNA的定量，1U酶的限制