annexina2抗体制备及其应用的实验分析

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1、内容摘要目的：为了研究人源膜联蛋白A2(AnncxinA2)在肿瘤发生发展中的作用，探讨annexinA2作为肿瘤分子靶点在肿瘤诊断及治疗中的应用，我们制备了其多克隆及单克隆抗体并进行了相关研究。方法：(1)用PCR克隆人的AnnexinA2的基因编码区，将其克隆入原核表达载体pET28a(+),构建原核表达质粒pET28a(+)/AnnexinA2.⑵将构建的原核表达质粒转化到大肠杆菌Eco〃BL21(DE3)屮，用IPTG诱导目的基因的表达，通过超声裂解和SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。表达的蛋白产物利用切胶回收的方法纯化，SDS-PAGE检测纯化情况，WesternBlot鉴定重组

2、蛋白。(3)将纯化并透析、浓缩的重组蛋白免疫兔子，耳缘静脉取血测定兔血清的效价，效价达到300000以上，动脉插管取血，收获的兔血清既为多克隆抗体。用间接ELISA方法测定抗体的效价，用Westernblot检测抗体的特异性，用细胞免疫荧光及FCM法检测细胞的定位。(4)将纯化并透析、浓缩的重组蛋白免疫Balb/C小鼠，取效价最高的小鼠作为待融合小鼠；分离该小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，通过HAT选择性培养基培养,间接ELISA法筛选，用有限稀释法单克隆化，获得稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。将阳性单克隆细胞腹腔注射至小鼠腹腔，收获腹水离心后的腹水上清作为单克隆抗体。用间接EL

3、ISA检测抗体的效价，WesternBlot和免疫共沉淀检测抗体的特异性。(5)将制备的抗体应用于WesternBlot、细胞免疫荧光(CIF)和流式细胞术(FCM),检测真核细胞中目的蛋白的本底表达情况。(6)用外源的annexinA2单克隆抗体处理HepG2细胞，用MTT法检测外源性抗体对细胞生长增值的影响;FCM检测细胞周期;RT-PCR和real-PCR检测细胞周期的相关基因；westernblot检测细胞周期相关基因中CDK6的表达情况；用划线法及transwell检测外源抗体对HcpG2细胞的侵袭及迁移的影响结果：(1)经酶切和DNA测序鉴定，pET28a什)/AnnexinA2

4、原核表达质粒的构建是正确的。(2)原核表达质粒转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),l.OmMIPTG可诱导AnncxinA2重组蛋白的表达，表达的重组蛋口以包涵体的形式存在。运用切胶回收的方法纯化重组蛋白，SDS-PAGE分析其纯度均在80%以上，WesternBlot(WB)鉴定显示重组蛋口各自兼有6xHis的标签。(3)将纯化的蛋口免疫口本大耳口兔后，制备了特异的高滴度的多克隆抗体(ELISA滴度达1：640000)oWesternblot(WB)检测抗体的具有较好的特异性。CIF和FCM结果显示抗血清与肿瘤细胞表达的annexinA2有高度特异的结合活性。⑷将纯化的重组蛋白作为

5、抗原免疫Balb/C小鼠后，经融合、筛选和克隆化，获得了四株阳性单克隆细胞株，并制备了腹水上清形式的单克隆抗体。ELISA检测四株单克隆抗体的效价均在1280000以上。就其中的一•株单抗经westernblot鉴定，制备的单抗不是6>

6、exinA2蛋白。CIF和FCM结果显示腹水形式的单克隆抗体与肿瘤细胞表达的annexinA2有高度特异的结合活性。（5）MTT结果表明，与对照细胞相比较，外源的annexinA2单克隆抗体能够抑制HepG2细胞的生长，并且随着抗体处理浓度的降低，抑制HepG2细胞生长的能力减弱；FCM结果显示，外源的单克隆抗体促使G1期延长，G2+M期的时间缩短，促使HcpG2细胞的生长周期阻滞在G0+G1期；RT-PCR和rcal・PCR结果显示，与对照细胞相比较，外源的单克隆抗体对HepG2细胞周期的相关基因的表达有一定的影响,抑制了细胞周期相关基因hCCDl,hE2Fl,CDK6的表达，并且随着抗体

7、处理浓度的降低，抑制hCCDl,hE2Fl,CDK6的表达能力减弱;westernblot结果显示,外源抗体的处理促使HepG2细胞的细胞周期蛋白CDK6的表达降低，并且随着抗体浓度的增大，抑制CDK6蛋白表达的能力增强：划线法及transwell结果显示，与对照细胞相比较，外源抗体的处理抑制HepG2细胞的迁移，但是促进了HepG2细胞的侵袭。结论：本研究构建了annexinA2的原核表达质粒及获得高纯度的