annexina2抗体制备及其应用的实验分析

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'annexina2抗体制备及其应用的实验分析'
内容摘要目的:为了研究人源膜联蛋白A2 (AnncxinA2)在肿瘤发生发展中的作用,探 讨annexinA2作为肿瘤分子靶点在肿瘤诊断及治疗中的应用,我们制备了其多克隆及 单克隆抗体并进行了相关研究。方法:(1)用PCR克隆人的AnnexinA2的基因编码区,将其克隆入原核表达载 体pET28a(+),构建原核表达质粒pET28a(+)/AnnexinA2.⑵将构建的原核表达质粒转 化到大肠杆菌Eco〃BL21(DE3)屮,用IPTG诱导目的基因的表达,通过超声裂解和 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。表达的蛋白产物利用切胶回收的方法纯化, SDS-PAGE检测纯化情况,Western Blot鉴定重组蛋白。(3)将纯化并透析、浓缩的重 组蛋白免疫兔子,耳缘静脉取血测定兔血清的效价,效价达到300000以上,动脉插 管取血,收获的兔血清既为多克隆抗体。用间接ELISA方法测定抗体的效价,用 Western blot检测抗体的特异性,用细胞免疫荧光及FCM法检测细胞的定位。(4) 将纯化并透析、浓缩的重组蛋白免疫Balb/C小鼠,取效价最高的小鼠作为待融合小 鼠;分离该小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过HAT选择性培养基培养, 间接ELISA法筛选,用有限稀释法单克隆化,获得稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细 胞株。将阳性单克隆细胞腹腔注射至小鼠腹腔,收获腹水离心后的腹水上清作为单克 隆抗体。用间接ELISA检测抗体的效价,Western Blot和免疫共沉淀检测抗体的特异 性。(5)将制备的抗体应用于Western Blot、细胞免疫荧光(CIF)和流式细胞术(FCM), 检测真核细胞中目的蛋白的本底表达情况。(6)用外源的annexinA2单克隆抗体处理 HepG2细胞,用MTT法检测外源性抗体对细胞生长增值的影响;FCM检测细胞周期; RT-PCR和real-PCR检测细胞周期的相关基因;western blot检测细胞周期相关基因中 CDK6的表达情况;用划线法及transwell检测外源抗体对HcpG2细胞的侵袭及迁移 的影响结果:(1)经酶切和DNA测序鉴定,pET28a什)/AnnexinA2原核表达质粒的构建是 正确的。(2)原核表达质粒转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3), l.OmM IPTG可诱导 AnncxinA2重组蛋白的表达,表达的重组蛋口以包涵体的形式存在。运用切胶回收的 方法纯化重组蛋白,SDS-PAGE分析其纯度均在80%以上,Western Blot (WB)鉴定 显示重组蛋口各自兼有6xHis的标签。(3)将纯化的蛋口免疫口本大耳口兔后,制备 了特异的高滴度的多克隆抗体(ELISA滴度达1: 640000)o Western blot (WB)检测 抗体的具有较好的特异性。CIF和FCM结果显示抗血清与肿瘤细胞表达的 annexinA2有高度特异的结合活性。⑷将纯化的重组蛋白作为抗原免疫Balb/C小鼠 后,经融合、筛选和克隆化,获得了四株阳性单克隆细胞株,并制备了腹水上清形式的单克隆抗体。ELISA检测四株单克隆抗体的效价均在1280000以上。就其中的一?株 单抗经western blot鉴定,制备的单抗不是6><His标签抗体。经western blot鉴定单克 隆抗体能特异性识别PC3 (前列腺癌细胞)、ECV (人血管内皮细胞)、T24 (膀胱癌 细胞)、HepG2 (肝癌细胞)、PANC1 (胰腺癌细胞)及癌组织表达的annexinA2蛋白, 而在癌旁组织中仅仅检测到很少量的本底表达的annexinA2蛋白;免疫共沉淀进一度 证实了单克隆抗体能特异性识别肝癌细胞内本底表达的annexinA2蛋白。CIF和FCM 结果显示腹水形式的单克隆抗体与肿瘤细胞表达的annexinA2有高度特异的结合活 性。(5) MTT结果表明,与对照细胞相比较,外源的annexinA2单克隆抗体能够抑 制HepG2细胞的生长,并且随着抗体处理浓度的降低,抑制HepG2细胞生长的能力 减弱;FCM结果显示,外源的单克隆抗体促使G1期延长,G2+M期的时间缩短,促 使HcpG2细胞的生长周期阻滞在G0+G1期;RT-PCR和rcal?PCR结果显示,与对照 细胞相比较,外源的单克隆抗体对HepG2细胞周期的相关基因的表达有一定的影响, 抑制了细胞周期相关基因hCCDl, hE2Fl, CDK6的表达,并且随着抗体处理浓度的 降低,抑制hCCDl, hE2Fl, CDK6的表达能力减弱;western blot结果显示,外源抗 体的处理促使HepG2细胞的细胞周期蛋白CDK6的表达降低,并且随着抗体浓度的 增大,抑制CDK6蛋白表达的能力增强:划线法及transwell结果显示,与对照细胞 相比较,外源抗体的处理抑制HepG2细胞的迁移,但是促进了 HepG2细胞的侵袭。结论:本研究构建了 annexinA2的原核表达质粒及获得高纯度的重组蛋白,免疫 日本大耳白兔及Balb/C小鼠后,分别获得高滴度特异性的多克隆及单克隆抗体。利 用自制的annexinA2单克隆抗体处理肿瘤细胞,可有效抑制细胞增殖和迁移。这些结 果提示annexinA2的表达与肿瘤发生发展具有一定的相关性,为肿瘤的诊断及治疗提 供了实验依据。关键词:AnnexinA2多克隆抗体单克隆抗体细胞周期细胞迁移AbstractObjective To study the role in tumor development and explore AnnexinA2 application, as of tumor molecular targets, in tumor diagnosis and treatment, we prepared AnnexinA2 polyclonal and monoclonal antibodies.Methods (1) Human AnncxinA2 gene coding region amplified by PCR was cloned into the prokaryotic expression vector pET28a (+). Prokaryotic expression plasmid pET28a (+) / AnncxinA2 was constructed?(2) The constructed prokaryotic expression plasmid was transfonned into Eco〃BL21(DE3), and induced the expression of target gene by IPTG to express recombinant proteins. The expression of recombinant protein was detected by ultrasound cleavage and SDS-PAGE. Recombinant protein product was purified using Gel Extraction? Inte
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