等温滴定量热仪(ITC)在分子相互作用中的应用

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1、等温滴定量热仪（ITC）在分子相互作用中的应用陈雍硕Yongshuo.Chen@ge.comIsothermalTitrationCalorimetry等温滴定量热ITC:测定分子相互作用的方法在一次实验中,ITC可以测定0•结合的亲和力常数(K),K•结合反应中的焓变和熵变(∆H,dfinjectant-2∆H∆S)o-1lo•结合位点数(n)alm-4Nkc实验也可以测定有多个结合00.51.01.52.0Molarratio位点的样品等温滴定量热仪(ITC)噪音0.5nanocal/second温度范围:2-80oC样品池体积:1.3

2、mlor0.2ml量热池对照池样品池∆T1：样品池温度反馈神奇的微量热控制—功率补偿SRTheDPisameasuredpowerdifferentialbetweenthereferenceandsamplecellstomaintainazerotemperaturebetweenthecells∆TDPReferenceCalibrationHeaterSampleCalibrationHeaterCellMainHeater∆T~0IsothermalTitrationCalorimetry实验流程1)样品池中加入待测大分子2)参照

3、池中加入缓冲液3)将待测配体吸入注射器中4)注射器置于样品池中5)调整温度、搅拌速度和每次注射体积典型ITC数据Time(min)0102030400-20cal/secµ-400-2-4-6Data:RNAHHH_NDH-8Model:1SitesChi^2=2795.38932-10N1.02眪0.00159-12K5.57E4眪1.01E3H-1.359E4眪29.18-14kcal/moleofinjectant0.00.51.01.52.0MolarRatio上半部分表示每次注射采集的数据。下半部分表示每次注射的释放的热量（上图中

4、每个峰的面积积分）对滴定抗原与样品池中抗体的摩尔比作图ITC理论基础∆G=-RTlnKB∆G=∆H–T∆S令人郁闷的公式说明了什么？1.相同的KD有着相同的∆G；2.相同的∆G却有着不同的∆H与∆S组合。引发焓变和熵变的主要因素Enthalpy(-∆H)焓变Entropy(+∆S)熵变HydrogenbondsHydrophobicinteractions氢键疏水作用IonicinteractionsConformationalfreedom离子作用构象自由度特异性结合非特异性结合ITC技术的应用领域分子相互作用：溶液中的几乎所有天然状态分

5、子：包括蛋白质、核酸、多肽、药物分子、脂类、金属离子、小分子等等；工艺过程的开发和控制酶动力学药物研发非生物系统抗生素抗性的菌种为什么能更好的消灭抗生素Tobromycinbindingtoaminoglycosidenucleotidyltransferase(2”)WithWithoutMgAMPCPPMgAMPCPPKD=0.64µMKD=0.21µM∆H=-18.2kcal/mole∆H=-12.6kcal/mole∆S=-34cal/mole/oK∆S=-12.3cal/mole/oKWrightandSerpersu,Bioch

6、emistry44,11581-11591(2005)DNA形成了三螺旋？DNAtriplexformationA120µMsolutionof15-mersinglestrandedDNAwastitratedintoa5µMsolutionof23-merdoublestrandedDNAat25oCin10mMSodiumAcetate,pH4.8K=1.1x10-8D∆G=-10.8kcal/mole∆H=-83.8kcal/mole∆S=-24.5e.uKamiyaetal.,JACS118,4532-4538药物结合的热动力学特

7、征1050e∆Goll/m-5∆Hakc-T∆S-10-15-20一样的亲合力，不一样的微观世界MicroCalApplicationNote:ITCandDrugDesignHIV蛋白酶抑制剂开发的“成长烦恼”e5000∆G∆H-T∆S0Unfavorabl-5000l/mol12YEARSca-10000-15000Favorable-200007IndinavirNelfinavirSaquinavirRitonavirLopinavirAtazanavirKNI-57KNI-272KNI-764TMC-126TMC-114Ampre

8、navirVelazquez-Campoyetal(2003)CurrentDrugTargetsInfectiousDisorders,3311Ohtakaetal(2004)