总RNA提取实验原理

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'总RNA提取实验原理'
总RNA提取实验原理、步骤和问题解答Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性,裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。无论是人、动物、植物还是细菌组织,各种样品最大使用量(1ml Trizol),动物组织( 50mg),植物组织(100 mg),丝状真菌( 100mg),动物细胞(5×106~1×107),酵母(1×107) 。TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如,从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色,可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带,(mRNA和hnRNA成分)两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S),低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8 。[实验用品]【实验耗材】1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl。酒精擦拭,头部重点,紫外线照射。2、吸头:1ml、200μl、20μl3、匀浆管:5ml4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl6、试剂瓶:2个60ml的棕色广口试剂瓶。青霉素小瓶(分装无水乙醇,高压的DEPC水,-20°C保存)。7、量筒:50ml、250ml、500ml8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml9、试管架:5ml、1.5ml、20μl10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水11、铝制饭盒:4个12、塑料小饭盒:1个13、大瓷缸:2个14、锡泊纸:一卷15、卷纸:2卷16、三角烧瓶:带盖,稍大(融琼脂糖)【实验仪器】天平、振荡器、高速离心机、0.5~10ul、20~200ul、100~1000ul加样器。【自备试剂】DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿,异丙醇,无水乙醇,0.05~0.1%DEPC-H2O,75%乙醇,TE缓冲液,琼脂糖。RNA抽提的准备工作【试剂配制】1.DEPC水: 1ml+1000ml双蒸水=1‰ DEPC水,1000ml容量瓶中静置4小时。2.75%乙醇:无水乙醇+DEPC水,-20℃保存(DEPC水需先高压)3.氯仿:棕色瓶4.异丙醇:棕色瓶【器具处理与准备】1.塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,小枪头需打入DEPC水,室温过夜,高压,烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)。胶塞同样处理。塑料器皿也可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。2.玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,1 ‰DEPC过夜,蒙锡纸,150°C烘烤4h,180°C,2h。或泡酸过夜,冲洗干净后高温烘烤,1 ‰DEPC过夜,高压。盛装乙醇,DEPC水用。3.匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)[实验内容和方法]一、抽提(一)组织抽提1.组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮。实验时,在液氮中将组织研磨成粉末,趁液氮未挥发将粉末转移到EP管,室温5000rpm离心去上清。每50-100mg组织,加入1ml Trizol。2.若是新鲜标本经匀浆后转移离心管,加入1ml Trizol。3.若组织量(1~10 mg)或细胞数很少(102~104),在样品中加入800 ul Trizol反复抽吸均匀,再加入糖原(终250ug/ml),剧烈振荡或用匀浆器匀浆。4.在匀化后和加入氯仿之前,样品可以在–60~70°C保存至少一个月。(二)细胞抽提1.倒掉培养基,PBS洗,直接将1ml Trizol 注入培养瓶(5×106),反复抽吸均匀。2.或收集细胞后加入Trizol 反复抽吸均匀。二、分相3.在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿(为Trizol总体积的1/5),振荡混均30秒,室温下静置5分钟.4. 12000 rpm 15分钟4°C,分相为三层。上层:RNA(约为Trizol的60%);中间:DNA;下层:蛋白质(酚-氯仿)。5.小心吸取上清液,转移到另一EP管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.4~0.6 ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质,避免触及。三、RNA沉淀6.上清液加入约0.5ml的异丙醇,振荡混均30秒。室温下静置10分钟。7.离心12000rpm 10分钟4°C。8. RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注意避免吸弃RNA沉淀。四、RNA清洗9.离心管加入1ml 预冷的75%乙醇(1mlTrizol至少1ml乙醇清洗DNA),振荡混均30秒,使沉淀振荡起来,室温12000rpm×1~2分钟。(有文献称不超过7500g离心)。尽可能吸弃上清液,防止RNA沉淀丢失。重复以上清洗步骤一次。在75%乙醇中,RNA在4℃至少保存1周,-20℃至少保存1年。10.室温选择流动性小,倒置离心管于滤纸上,干燥RNA,但不能完全干燥(5~10分钟)。用DEPC水15μl溶解沉淀,55-60℃孵育10~15分钟。11.测量OD值后,样品放置-70℃保存,一个月五、RNA、DNA浓度的计算取78μl DEPC水加2μl 第10步液体,则稀释倍数为40倍。【RNA】=A260 X 40 X n/1000μg/μl【DNA】=A260 X 50 X n/1000μg/μl(n为稀释倍数)分离RNA的理想效果是A260/A280=1.8~2.0A260代表RNA OD值;A280代表蛋白OD值[注意事项]1. RNA产量:每1 mg组织或1×106培养细胞预期的RNA产量(1)肝和脾,6—10μg(2)肾,3—4μg(3)骨骼肌和脑组织,1—1.5μg(4)胎盘,1-4μg(5)上皮细胞(1×106 ,8—15μg cultured cells)(6)纤维母细胞(1×106 ,5—7μg cultured cells)2.电泳检测: 制备甲醛变性,1%琼脂糖凝胶快速电泳,25ug/lane,65V,2.5h,检测RNA分子完整性,观察18S、28S条带。3. RNA沉淀完全干燥,会极大地降低可溶性。部分溶解的RNA其A260/280比值&1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶解RNA,并在55~60°C下孵育10分钟,当RNA以后要用于酶切反应时,
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