生物催化论文

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1、利用介孔硅酸盐对南极假丝酵母中脂肪酶B的化学修饰和固定化摘要：对南极假丝酵母（CalB）屮的脂肪酶B进行化学修饰并将其固定在三种不同的介孔硅酸盐（MPS）中，用两种双功能试剂EGNHS和戊二醛以及单一功能的柠康酸阡对可溶性的CalB进行修饰。经过化学修饰和耒经处理的他均通过吸附固定在SBA-15,CNS和MCM型介孔硅酸盐上，并对经过溶解和I古I定化预处理的化学修饰的CalB进行热稳定性评价和比较。结果表明，在70°C条件下，柠康酸酊明显地降低了CalB的热稳定性，而与H然状态下游离的CalB相比，两种双功能性的试剂都将它的热稳定性提高了8倍。经EGNHS处理过的

2、CalB接著固定在CNS-MPS±,其稳定性提高了六十儿倍，同时，这种方法的结合被证明是最有效的能提高稳定性的方法。CalB也更易吸附在孔径更大的SBA-15型MPS上，而且CalB经藻酸盐固定后热稳定性也比较好。1.前言脂肪晦加于水解齣类，催化由LT油利长链脂肪酸形成的酯类的水解。它们也水解其他类型的底物，然而，它们能够催化底物进行酯化反应和转酯化反应，这些功能使脂肪酶在牛物技术工业领域得到广泛应用，比如在对映体纯的药品和精细化学品的合成、乳制品产业、石油加工及化合物和食晶的调味料加工这些方而的应用。研究发现，脂肪酶在动物、植物、真菌和细菌中广泛存在。CalB是

3、从南极假丝酵母屮分离出来的一种非常有研究价值的酶，也许在工业上是脂肪酶中最重要的一个，因为它能够催化多种多样的反应、不溶于有机溶剂、适当的热稳定性、立体定向性和高度的对映选择性。Uppenberg等人测定了CalB的X射线晶体结构，发现该酶由317个氨基酸纟fl成，分了质量人约为33kDa,等电点为6.0。与其他脂肪酶相比，CalB只冇一个小的活性位点盖了，所以它的活性位点暴露于溶剂中。对一些特定的底物，它不会表现出一个脂肪酶所具有的典型的界面活性。这些性质使它能催化进行相当多的反应。尽管相对而言CalB是稳定的，但是在工业过程中采用一种可重复使用和更稳定的形式可

4、以使它的能力得到加强，从而能够提供更有利的工艺经济性。将酶同定在固体颗粒上使复性后的酶能反复利用。另外，固定化和化学修饰是提高酶的稳定性的两种常用方法。比如利用聚乙二醇单甲陋（MPEG）进行表面残留物的化学修饰，将醐固定在琼脂糖、壳聚糖、绿色的椰了纤维上以及利用棊因工程的突变体进行特定位点的固定。通过利川不同的固定化方法可以捉高特定酶的对映选择性。现阶段研究的目的是找岀一种能够提高CalB热稳定性的固定化方法，从而能应用到工业化规模生产。该方法就是对游离的、可溶的醜进行化学修饰，即将酶吸附固定到不同类型的介孔硅酸盐上或包埋在藻酸盐中，然后用单功能或双功能试剂进行处

5、理。我们对将这两种操作结合后能否产牛•额外的稳定作用感到好奇。我们的这种双重处理方法完全不同于Montes等人的做法，将酶固定在带负电荷的支持物上之前，他们先将青霉索G酰化酶进行氨基化。这种氨基化并不是想要提高酶口身的稳定性，而是增加蛋口质和同体介质Z间的接触位点的数冃：稳定性的提高与蛋白质的固定数冃相关。Hidalgo等人所采用的方法完全不同，他们先对低聚过氧化氢酶进行初步的比较稳定的固定，接着利用衙聚糖醛对固定化陆进行更加稳定的交叉连接反应。本实验毎一步（在溶解性上修饰和固定到固体介质上）的冃的都是想提高酚口身的稳定性，同时希望这两种方法的结合能产生额外的稳定

6、增益。所选择的化学修饰反应冃的是想将游离的氨基酸棊团（包括赖氨酸侧链）覆盖在酶的表面，CalB的赖氨酸含量大约是整个猶表面积的2-3%o酸阡Z前已经被证明可以固定大量的酶，包括漆輛和木瓜蛋白III于酰化宁康酸酹对氨基酸基团的专一性、使用简单以及在变化的条件卜•易于脱酰基，因此本实验使用这种酶。另外两种试剂是双功能交联齐U，即EGNHS和戊二醛。戊二醛经常被用来交联两种溶酚（分了间或分了内）和用来提高先前通过简单的吸附固定到支持物上的蛋白质的稳定性。它也被用来合成CLEAs,即-•种对•大量腮都适用的技术。EGNHS是一种双功能试剂，先前已经成功地用來固定辣根过氧化

7、物酚和胰蛋白酶。许多报道描述了通过吸附固定到MPS上来实现酶的固定化（比如胰蛋白酶、氯过氧化物酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶）。MPS比较吸引人的特性包括达到1000m2/g的巨人的表血积、化学和机械稳定性以及对微生物侵扰的抵抗性。Deere等人已经概述了影响蛋口质吸附固定到MPS上的因素。本实验采用三种不同类型的MPS來实现CalB的吸附固定化，即MCM41/98,SBA-15和CNS.MPS的孔间隙町以被有机硅烷组修饰,从而进一步提高一些蛋白质的稳定性。我们所有CalB处理效果均从它们的水解活性、修饰的程度、在温度升高条件下的热稳定性进行评价。固定在MPS±

8、的猶也通过