HeLa细胞的反式作用因子CTFNF-1与其顺式作用元件

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1、遗传学报，21(4);321----329,1994减ctaCeneticaSinicaHeLa细胞的反式作用因子CTF/NF-1与其顺式作用元件的特异性作用①谷春刘连瑞王恢鹏冯尚杨涛兰（中国科学院遗传研究所北京100101)摘要本文运用凝胶延迟反应（GelRetardationAssay）和足迹法(Footprinting）研究THeL：细胞核蛋白中的反式作用因子CTF/NF-1与其对应的顺式作用元件的特异性作用。研究结果表明HeL：细胞的CTF/NF-1包含有不同分子量的组分，它们均能特异性结合于特异位点ATATTGGCT

2、TCAAGCCAAAATGGA序列，形成至少5种不同分子量形式的因子－元件复合物。这一结果对阐明CTF/NF-1复杂多样的调控机制及其组成种类有重要意义。此外，本文还建立了一种制备核蛋白提取物的新方法，有效地解决了因反式作用因子含里极低带来的研究上的困难。关艘词CT列NF-1，反式作用因子，顺式作用元件，凝胶延迟反应，足迹法‘真核基因表达调控体系中最关键的是转录水平的调控，它包括RNA聚合酶、顺式作用元件和反式作用因子三方面的协同作用。顺式作用元件必须结合特定的反式作用因子才能促使RNA聚合酶启始转录。目前在真核细胞中已发现有

3、多种反式作用因子，按其分布和功能分为组成型、组织特异型和诱导型3类。CTF(CCAAT-bindingtranscriptionfactor）是一种组成型反式作用因子，它广泛存在于多种组织中，结合于由RNA聚合酶11转录的多种基因启动子中的CCAATbox，调节转录活性。最近的研究进展表明它对转录活性有双重调节功能，它能刺激某些基因的转录活动而对另一些基因的转录则起抑制乍用L"ONF-I(nuclearfactor-1)具有强烈刺激腺病毒DNA复制的功能，它可能促进复制起始位点一个多酶复合物形成，可使复制起始反应增强30倍[6

4、]进一步的研究表明它在多种真核基因的调控区有其结合位点，其保守序列为反向重复序列TTGGCT(N),-AGCCAAW，据估算，人的基因组上有60000个NF-I结合位点rnoKatherineA,Jones等详细比较了CTF与NF-1，发现它们的结合位点序列具有同源性，CCAATbox与NF-I位点的反向重复序列的一半很相似，亲和层析纯化的CTF与NF-1均是由52-66kD范围的多肤链组成，它们在结合DNA特异性方面、免疫交叉反应性以及体外刺激DNA复制与转录活性等方面均无差异，由此证实了CTF与NF-I是同一种反式作用因子

5、，称为CTF/NF-11"I。它对于DNA复制和转录都具有重要调控作用，其作用机制是复杂的。目前通过研究顺式作用元件与反式作用因子及其相互作用方式，进而揭示真核基因表达调控机理，这已成为当今分子生物学最重要的前沿研究领域之一，这也正是本文的研0本文于1993年10月26日收到。本研究为中国科学院遗传研究所所长基金资助课题322遗传学报21卷究意义所在。1材料和方法1.1材料HeLa细胞株由本所培养，SephacrylS-300凝胶、Bandshiftkit和SureTrackP:)otprintingkid均为瑞典Pharma

6、cia公司产品，[a--32P]dCTP和［。一”P]dATP脸S'-AATTCCCTAAGAAACCATTATTATCATGACATAACCTAT自福瑞公司。凝胶延迟反应和‘3'-GGGATTCTTGGTAATAATAGTACTGTAATTGGATA足迹反应中使用的探针相同，它来源于SureTrackFootpri--人AAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTTTTATCCGCATAGTGCTCCGGGAAAGCAGAAGTTCTTAntin9私、，真佳隽；酗瓜狠八。1.2方法丁GGA

7、TCCTATCTGGG-.NGCATATGCTATCCTAATGGATCG1.2.1S-300蛋白的制备ACCTAGGATAGACCCATCGTATACGATAGGATTACCTAGG用含，外小牛血清的RPMLTCTAGATCCATCATATTGGCTTCAAGCCAAAATGATCTA1640培养基大量培养HeLa.AGATCTAGGTAGTATA人CCGAAGTTCGGTTTTACCTAGAT细胞，对数期收获。采用JohnDavidDignam方法制备核粗ATTCTCATGTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTC

8、AGTC八TAAGAGTACAAACTGTCGAATAGTAGCTATTCGAGTCAGT提物‘91。向粗提物中加硫酸钱至53％饱和度‘，‘，，4cC静置过CG-FAGCGATAGCGGAGTGTATC3'夜，离心35000g30分钟，将、CCATCGCTATCGCCTCAC