特殊光学显微镜的原理与使用

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1、特殊光学显微镜的原理与使用暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜偏光显微镜干涉显微镜体视显微镜倒置显微镜共聚焦显微镜暗视野显微镜根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜。不让直射光线进入物镜的镜头，而是先让直射光线经过暗视野聚光器后改变途径，使其斜向射向被检物体。能观察到明视野下看不到的极其微小的物体，可判断物质颗粒的存在与否。最高分辨率可达0.004um,”超显微镜术“换上暗视野聚光器并在聚光器透镜的上表面滴上镜头油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片下表面缓缓接触。只有在油滴与载玻片的底面相接触后，光线才能射向标

2、本。将视场光圈适当缩小，用10倍物镜找到被检物体，同时可在视场中看到视场光圈的轮廓像。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈的像清晰可见。步骤相差显微镜的特点光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化。因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。相差显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到

3、或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构相差显微镜的成像原理镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时

4、，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。相差显微镜的结构和装置1、环状光阑具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。相差显微镜的结构和装置2、相板位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样标在物镜外壳上。相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银

5、等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线吸收掉60%—93%，相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位推迟1/4波长。相差显微镜的结构和装置3、合轴调节望远镜是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符号

6、），用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面暗环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。相差显微镜的结构和装置4、绿色滤光片由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用

7、绿色滤光片来调整光源的波长。Olympus厂家生产的相差显微镜在镜检时要使用该厂规定的IF550绿色滤光片作为配套器件。相差显微镜的使用范围相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。相差显微镜的操作步骤（1）根据观察标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。（2）将标本片放到载物台上。（3）进行光轴中心的调整。（4）取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻

8、合，然后取下合轴调节望远镜，换回目镜。在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。（5）放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检操作与普通光学显微镜方法相同。相差显微镜的注意事