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1、人TLR2胞外区基因原核表达及其抗体制备作者：孙守勋，李强，刘静，李玲，蒲晓允【摘要】目的：在原核系统中表达人Toll样受体2CTLR2)胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法：应用RTPCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)上构建重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达，目的融合蛋白经NiNTA亲和层析纯化，用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰白兔，制备多克隆抗体，采用Westernblot对抗体进行鉴定，并用ELISA分析抗体活性。结果：成功构建了pET32a(+)TLR2
2、重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达，获得了纯化重组蛋白，重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生，并具有良好的免疫活性。结论：成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白，制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础。【关键词】TLR2；原核表达；多克隆抗体；单个核细胞Toll样受体作为细胞表面的模式识别受体，能够对病原体识别、结合、引发一系列信号间的转导，促进各种炎性介质的释放，对宿主的天然免疫防御具有重要作用，目前其家族成员至少有11个［1］。TLR与天然免疫应答关系的研究中，倍受关注的是TLR2和TLR4O其中TLR2识别的配体最多，可协助TL
3、R4参与人体内对LPS的反应。在TLR2的结构中其胞外区富含亮氨酸的重复序列，是配体作用的关键功能区域。我们应用RTPCR方法从人外周血单个核细胞中克隆TLR2胞外区基因，并利用原核表达体系表达该基因的融合蛋白，制备多克隆抗体并检测其活性，为进一步研究TLR2胞外区的功能奠定必要的基础。1材料和方法1.1材料淋巴细胞分离液购自天津TBD公司，Tripure购自Roche公司；AMV反转录酶、Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoRI和SalI均为TaKaRa公司产品；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自博大泰克公司；LPS、IPTG、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂为
4、Sigma公司产品；羊抗兔IgG抗体购自北京中山公司，原核表达载体pET32a(+),抗His抗体和NiNTA亲和纯化试剂盒购自Novagen公司，大肠杆菌DH5a、BL21(DE3)由本院中心实验室保存。其余试剂为进口及国产分析纯，实验用仪器和动物为本院和学校中心实验室及实验动物中心提供。引物合成及DNA测序由上海英骏生物公司完成。1.2方法1.2.1人外周血单个核细胞的分离与培养在本院检验科门诊收集体检患者的静脉血（EDTA抗凝），其各项血液指标均正常，按操作说明用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，PBS洗涤后培养于RPMI1640培养液中（含100mL/L胎牛血清
5、，脂多糖溶液10g/L,青霉素10万U/L）o细胞经脂多糖刺激培养后，提取RNA。1.2.2总RNA的提取以Tripure分离试剂提取细胞总RNA,具体步骤按德国Roche公司的TripureIsolationReagent操作说明进行。总RNA-70°C保存。1.2.3逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增目的片段由GenBank下载人TLR2全序列，并根据原核表达载体pET32a（+）上的多克隆位点采用PrimerPremier5.0设计一对TLR2胞外区扩增引物。上游引物为5’GCCGAATTCATGCCACATACTTTGTGGATGGT3’；下游引物为5'CG
6、GGTCGACTCACATTAAGGGTACAGTCATCAG3'。其中上游引物的5’端引入EcoRI的酶切位点（下划线表示），下游引物的5’端引入SalI的酶切位点（下划线表示），内含启动子ATG和终止密码子TCA。以提取的细胞总RNA为模板，按常规方法建立逆转录反应体系及条件合成cDNAo采用降落PCR（TouchdownPCR,TDPCR）的方法设置反应条件，按引物的最小Tm值减5度设定温度梯度。反应条件为：先在94°C变性3min后，94°C,30s；62°C,1min；72°C,1min；10个循环，94°C,30s；60°C,1min；72°C,1min；
7、10个循环，94°C,30s；57°C,1min；72°C,1min；10个循环，94°C,30s；55°C,1min；72°C,1min；12个循环，最后72°C延伸10mino10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，切胶纯化回收目的片段。1.2.4重组原核表达载体的构建与鉴定用EcoRI和SalI分别双酶切纯化回收的目的基因片段和pET32a(+)表达质粒，经琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收后，用T4DNA连接酶16£过夜连接载体和目的片段，得到重组表达载体pET32a(+)TLR2o重组质粒转化感受态表达菌株BL21(DE3),涂布Amp+的LB平板
