仪器分析课件_第03章

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仪器分析 第三章 高效液相色谱 使用教材:朱明华编 分析 主讲教师:韩 权2019-10-29 第一节 高效液相色谱法的特点一、概述二、特点 1.高压:一般可达150~350×105 Pa。 2. 高速:一般可达1~10 ml/min。 3. 高效:近来研究出许多新型固定相,使分离效率大大提高。 4.高灵敏度:如荧光检测器灵敏度 -11可达10 g。另外,用样量小,一般几个微升。 5.适应范围宽: 2019-10-29第二节、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 一、液相色谱速率理论—影响色谱峰扩展因素 2019-10-29 提高柱效的途径: 减 小填料粒度以加快传质速率;提高柱内填料装填的均匀性。 二、. 影响分离的因素——流速 由图3-1知,液相色谱H---u 曲线与其相色谱不同,当流速大 于0.5 cm/s时,是一段斜率不大 的直线,只是因为分子扩散相对 H值的影响可以忽略不计。在液 相色谱中,使用较高流速,柱效 下降不明显,有利于实现快速分 离。 2019-10-29 第三节、高效液相色谱法的主要分离类型1 .液 — 液分配色谱法及化学键合相色谱 流动相和固定相都是液体。当试样进入色谱柱,溶质在两相间进行分配。达平衡时,服从于下式: a. 正相液—液分配色谱法: 流动相的极性小于固定液 的极性。 b. 反相液—液分配色谱法: 流动相的极性大于固定液 的极性。 c. 液—液分配色谱法的缺点:固定液在流动相中仍有 微量溶解;流动相通过色谱柱时的机械冲击力,会造成固 定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相,可克 服上述缺点。 2019-10-292. 吸附色谱(液-固吸附色谱) 流动相为液体,固定相为吸附剂(如硅胶、氧化 铝等)。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。 其作用机制是:当试样进入色谱柱时,溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附 (未进样时,所有的吸附剂活性中心吸附的是S),可 表示如下: Xm + nSa ====== Xa + nSm 式中:Xm--流动相中的溶质分子;Sa--固定相中的溶剂 分子;Xa--固定相中的溶质分子;Sm--流动相中的溶剂 分子。当吸附竞争反应达平衡时: K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中:K为吸附平衡常数。[讨论:K与保留值的关 系] 2019-10-293. 离子交换色谱 IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换 树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进 行可逆交换,依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将 它们分离。 以阴离子交换剂为例,其交换过程可表示如下: X -(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中) 当交换达平衡时: KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-] 分配系数为: DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-] [讨论:DX与保留值的关系] 2019-10-294 .离子对色谱法(Ion Pair Chromatography) 离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物,从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示: X+水相 + Y-水相 === X+Y-有机相式中:X+水相--流动相中待分离的有机离子);Y-水相--流动相中带相反电荷的对离子(如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等);X+Y---形成的粒子对化合物。 当达平衡时: KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相根据定义,分配系数为: DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相 = KXY [Y-]水相 离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题,诸如酸、碱和离子、非离子混合物,特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。 2019-10-295 .离子色谱法(Ion Chromatography) 原理: 用离子交换树脂为固定相,电解质溶液为流动相。 以阴离子交换树脂(R-OH)作固定相,分离阴离子(如Br-)为例。当待测阴离子Br-随流动相(NaOH)进入色谱柱时,发生如下交换反应(洗脱反应为交换反应的,的逆过程): 以电导检测器为通用检测器,为消 除流动相中强电解质背景离子对电导检测 器的干扰,设置了抑制柱。试样组分在分 离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色 谱法相同。 2019-10-29离子色谱具有以下优点: (1)分析速度快 可在数分钟内完成一 个试样的分析; (2)分离能力高 在适宜的条件下,可使 常见的各种阴离子混合物 分离;例:使用双柱法, 在十几分钟内,可使七种 阴离子完全分离。(3)分离混合阴离子的最有效方法(4)仪器流路采用全塑件,玻璃柱,耐腐蚀 2019-10-29离子色谱的应用阴离子分析: 双柱;薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm), -1 -1流动相:0.003mol·L NaHCO3 / 0.0024 mol·L Na2CO3,流量138 mL/h。 七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离,各组分含量在3~50 ppm。 2019-10-296. 空间排阻色谱(Steric Exclusion Chromatography) 以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立 体网状结构和不同孔径(x nm~x00 nm)的多聚体的通称。 如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶;多孔硅胶、聚苯乙烯 凝胶等硬质凝胶。 机理:当试样进入凝胶色谱柱时,尺寸过大的分子 完全不能渗透到胶孔中去而受到排阻,沿胶粒之间的间隙 直接流出色谱柱,产生一个色谱峰;尺寸过小的分子可完 全渗透到胶孔中去,流动速度慢,最后流出色谱柱,产生 一个色谱峰;中等尺寸的分子 ,以其大小的不同,可渗透 到某些孔穴而不能进入另一些空穴,流出速度取决于分子 尺寸的大小, 按分子尺寸由大到小的顺序先后流出色谱柱, 从而实现分离。 应用:适合分离分子量大的化合物(100~800,000), 只要相对分子量相差大于10%。 2019-10-29一、液—液色谱法及离子对色谱法固定相1.担体(1) 全多孔型担体:a. HPLC早期使用的担体与GC类似,是颗粒均匀的多孔球体, 如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的Φ?100μm全多孔 型担体。缺点:填料的不规则性和较宽的粒度范围会导致 填充不易均匀,柱效低;填料孔径分布不一,并存在“裂 隙”在填料深孔中形成滞留液体(液坑),溶质分子在深 孔中扩散和传质慢,使色谱峰变宽,柱效下降。b. 现在采用Φ〈10 μm全多孔 型担体,它是由nm级的硅胶微粒堆积而成Φ为5 μm或稍大的全多孔小球。优点:颗粒小而均匀,传质快(距离短),柱效高。 2019-10-29 (2) 表层多孔型担体(薄壳型微珠担体): 它是直径为 30 ~ 40 μm 的实心核 ( 玻璃微珠 ) ,表层 上附有一层厚度约为 1~ 2μm 多孔表面 ( 多孔硅胶 ) 。优点:孔穴浅(固定相仅为表面的一薄层),传质速度快,易于填充均匀,柱效高。缺点:柱子容量低、需要配用高灵敏检测器。 这种担体目前应用较为普遍。2.固定液 液—液色谱流动相和固定相都是液体,因此要求两相要互不相容。在液-液色谱中常用的固定相也只有极性不同的几种,如β,β'-氧二丙腈、聚已二醇-400和角鲨烷等。 2019-10-293.化学键合固定相: 即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担 体表面。根据在硅胶表面 (具有≡Si-OH基团) 的化学反 应不同,键合固定相可分为:u 硅氧碳键型(≡ Si-O-C ):u 硅氧硅碳键型(≡Si-O-Si-C):稳定,耐水、耐光、耐有 机溶剂,应用最广。u 硅碳键型(≡Si-C):u 和硅氮键型(≡Si-N): 2019-10-29化学键合固定相具有如下一些特点:ⅰ . 表面没有坑,比一般液体固定相传质快得多; ⅱ . 无固定液流失,增加了色谱柱的稳定性和寿命; ⅲ . 可以键合不同官能团,能灵活地改变选择性,应用于多种色谱类型及样品的分析; ⅳ . 有利于梯度洗提,也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。 2019-10-292019-10-29二、液-固吸附色谱法固定相    采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等, 仍可分为全多孔性和薄壳型两种,其特点如前所述。三、离子交换色谱法固定相 ? 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体,在它的 表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基团键合在 惰性担体表面。 2019-10-29四、排阻色谱法固定相1. 软质凝胶:如交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等,适用 于水为流动相,在常压下使用。2. 半硬质凝胶:如苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚凝胶 (交联聚苯乙烯凝胶),是应用最多的有机凝胶,适 用于非极性有机溶剂。3. 硬质凝胶:如多孔硅胶、多孔玻璃珠等,多孔硅胶是 用得较多的无机凝胶。 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大,流动相 性质影响小,可在较高流速下使用。 2019-10-29 第五节  液相色谱法流动相 选择流动相时应注意下列几个因素:(1) 流动相纯度:防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测 器噪声增加。  (2) 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子: 如在液-液色谱中,流动相应与固定液互不相容,否则,会 使固定液溶解流失;酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。
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