第五章毛细管电泳

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第五章 毛细管电泳法 High performance capillary electrophoresis毛细管电泳的基本概念及主要应用 毛细管电泳? 毛细管电泳 指一系列以内径10 ~ 200μm的毛细管柱为分 离通道,以高压直流电为分离动力对大分子和小 分子等进行高效分离和检测的有关技术的统称? 毛细管电泳和传统电泳的区别 ? 传统的电泳是在平板凝胶的两端加上一定的电 压使组分分离 ? 毛细管电泳是在散热效率极高的毛细管内进行, 它可以加上 0 ~ 30 KV 的高电压进行分离,达 到快速、高效 毛细管电泳的特点?毛细管的特点 ? 容积小,以100㎝长、75μm内径的毛细管计, 容积仅为4.4 μl ? 侧面/截面积比大,使毛细管散热快,能承受 100 ~ 1000V/cm的高电场 ? 能使用自由溶液、凝胶等作为支持介质 ? 在溶液介质下能产生平面形状的电渗流 毛细管电泳的特点(续)? 毛细管电泳的特点 ? 高效:区带电泳中,柱效一般为几十万~ 几百万理论塔扳/米 ? 快速:多数分析在10分钟内完成,有的可 以在60秒内完成 ? 高灵敏度: 紫外检测器 10-13~10-15mol 荧光检测器 10-19~10-21mol ? 微量: 进样量 1~10 nL 样品量 5ul~5 mL ? 检测 :在线检测 毛细管电泳的特点(续)? 重现性: 迁移时间? ? 0.5%? 经济:实验消耗不过几ml缓冲液,没有泵输 送系统? 样品对象广:从无机离子到整个细胞,具有 包罗“万能”的分析功能和潜力? 自动:CE是目前自动化程度最高的分离方法 自动进样,缓冲液交换,数据处理? 洁净: 毛细管电泳与平板凝胶电泳的比较 毛细管电泳 平板凝胶电泳 检测器选择 多 少 定量 与 HPLC 相当 困难 自动化 容易 困难 分辨率 高 低 毛细管电泳与HPLC的比较?相同之处: 1. 快速高效分离技术 2. 可定量 3. 全自动化 4. 可用不同模式 5. 在许多领域逐步取代HPLC 毛细管电泳与HPLC的比较不同之处: 毛细管电泳 HPLC 1、根据 电泳淌度差异 保留时间差异 2、分离效率(N) 与扩散系数(D) 与扩散系数(D) 成反比 成正比 3、样品量 纳升(nl)级 微升(ul)级 4、检测 在线检测 柱后检测 5、制备量 微量制备 常量制备 毛细管电泳的主要应用? 手性化合物? 碱性药物分子? 法医毒物/临床毒理 分析与微量制备? 蛋白质/多肽/氨基酸? 糖类/糖蛋白? 核酸/核苷酸 ? 无机及有机离子/有机酸? 其它小分子? 水溶液中分子间的相互作用? 单细胞分析? 药物与细胞的相互作用 手性/异构体拆分? 方法简单化? 改善分辨率? 快速? 成本降低? 方法开发过程简单碱性药物分析—19种混合碱性药物的质量 控制分析 在其它药物分析中的应用? 主成分的定量测定? 痕量杂质检测? 中药材成分分析/指纹图谱? 中药复方制剂中化学成分测定? 药物计量离子配比测定? 药物代谢产物测定? 药物与蛋白质的相互作用研究? 滥用药物测定? 药厂质控 在蛋白质和多肽分析中的应用? 肽、蛋白和糖蛋白的鉴别? 结构分析? 纯度检测? 非均一性、多样性研究? 稳定性研究? 结合和动力学研究? 定量测定? 等电点测定? 蛋白质和多肽的质量控制? 微量制备 在糖类/糖蛋白中的应用? 多糖谱图的制定? 水化合物分离及测定? 蛋白分析? 构体分析? 糖脂研究 在核酸/核苷酸分析中的应用? 核酸、基因疫苗的质量控制? 碱基、核苷和核苷酸的分析? 纯度检测、片段收集和微量制备? PCR产物分析和dsDNA分析? 蛋白质-DNA相互作用测定? 基因突变测定? 基因表达测定? DNA序列测定(CEQ2000XL) 在临床医学中的应用? 临床疾病诊断? 临床蛋白分析? 基因诊断? 病毒检测? 临床药物检测? 药物代谢研究? 临床分子生物学测定? 毒物、滥用药物测定 CE/MS/MS联用技术及应用? 药物的结构? 药物及其代谢产物分析? 蛋白质和多肽结构? 蛋白质酶解产物测定? 核苷酸、DNA结构? 其它领域的应用 在其它工业领域中的应用? 药品纯度及杂质检测? 石油化工产品杂质监测? 食品中有机酸检测及矿物 质分析? 环境污染物分析? 金属阴和阳离子、无机离 子检测? 烟草中成分检测? 纺织染料的测定? 表面活性剂测定 毛细管电泳存在问题? 使用了小管径的毛细管,制备能力差? 光路短,要用高灵敏度的检测器检测样品? 凝胶、色谱填充管要用专门的灌制技术? 大的侧面/截面积比会“放大”吸附的作用, 导致蛋白质等的分离效率下降或无峰? 吸附会引起电渗的变化,进而影响分离重现性 毛细管电泳与HPLC的互补结合应用? 逐步代替许多HPLC 的功能—— ? 手性拆分、蛋白质分析、碱性药物、 ? DNA分析、毛细管电泳中药指纹图谱、 ? 药物的质量控制、杂质测定? 在制备功能上是互补的: ? HPLC 强调较大的制备量 ? CE 强调可获得极高的纯度基本理论 分离原理 高效毛细管电泳是离子或荷电粒子以电场为驱动力,在毛细管中按淌度或/和分配系数不同进行高效,快速分离的一种电泳新技术 例:以应用最多的毛细管区带电泳(CZE)为例 在移动过程中,由于样品组分间的淌度不同,它们的迁移速度不同,所以经过一定时间后,各组分就按其速度或淌度的大小顺序,依次到达检测器检测窗口被检出,这样就可以得到按时间荷响应值(A)分布的电泳谱图分离原理 毛细管和电泳 槽中充有相同组分 和相同浓度的背景 电介质溶液,样品 从毛细管的进样端 导入。当毛细管两 端加上一定的电压 后,荷电溶质便朝 着与其电荷极性相 反的电极方向移动。 毛细管电泳预备知识偶电层和Zeta电势 偶电层是浸没在液体中的所有表面都具备的一种特性, 通常是指两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离 子组成的与表面电荷异号的离子层 按照近代偶电层模型,在偶电层溶液一侧由两层组成: 第一层:吸附层,又称为斯特恩(Stern )层或 紧密层(Compact layer)第二层:扩散层diffuse layer ψ0为表面电势 ,它在stern层中线性地降到Ψd,它是stern面和溶液内部的电势差,和特性吸附离子的性质和数量有关。在stern面外侧很近的地方有一剪切面,是紧贴在固相表面粘度迅速变化的区域,我们把剪切面上的电势称为zeta(ξ)电势,其值略低于Ψd,公式计 4???e ? ? ? 式中:e—溶液中每单位面积总 的过剩电荷 ε—介质的介电常数 δ --扩散层的厚度,它和电 介质浓度(C)有关, 确切地说,和溶液的离子 强度有关 毛细管电泳中的zeta电势第一种:毛细管壁上的zeta电势 熔硅毛细管表面上的zeta电势正比于它表 面上的电荷数与对离子层厚度的乘积,但电 荷数和对离子层厚度又会受到对离子的性质、 缓冲液的pH、缓冲液中阳离子和熔硅基表面 间的平衡等因素的影响。 对于熔硅或聚四氟乙烯材质的毛细管,管 壁上的zeta电势是毛细管电泳中的一个重要 参数,对控制电渗流、优化毛细管分离有重 要意义。 毛细管电泳中的zeta电势第二种:荷电粒子表面上的zeta电势 在电介质中,任何带电粒子都可以被看成 是一个偶电层系统的一部分。在这个系统中, 粒子自身的电荷被异号的带电离子中和,这些 异号离子中有一些被不可逆地吸附到粒子上, 而另一些则游离在附近,并扩散到电介质中进 行离子交换。“固定”离子有一个切平面,它 和离得最近的游离离子间的电势称为粒子的 zeta电势。 电泳 在半导体中,荷电粒子在外电场作用
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