DB21∕T 1887-2011 猪瘟鉴别诊断技术规范

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1、ICS65.020.30B41DB21辽宁省地方标准DB21/T1887—2011猪瘟野毒株与疫苗株鉴别诊断技术规范Techniquesspecificationfordetectionanddifferentiationofwild-typeandvaccine—virusesofClassicalSwineFevervirus点击此处添加与国际标准一致性程度的标识2011-01-17发布2011-02-01实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/TXXXX—2011前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则并起草。本标准附录A为资料性目录。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准

2、由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准由辽宁省质量技术监督局发布。本标准负责起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准起草人：段亚良于学武杨本勇于长泳魏澍赵培兰德松李璐高志峰杨庆民王宏燕吴运谱5DB21/TXXXX—2011猪瘟野毒株与疫苗株鉴别诊断技术规范1　范围本标准规定了猪瘟临床诊断、病理学诊断、常规病原学诊断试验以及CSFV野毒与兔化弱毒疫苗株的复合荧光定量RT-PCR的鉴别诊断技术方面的要求。本标准适用于辽宁省生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上实验室对猪瘟野毒株与疫苗株的鉴别诊断。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版

3、本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。猪瘟诊断技术GB/T16551-2008《中华人民共和国动物防疫法》3　临床诊断按GB/T16551-20082.2进行。4　病理学诊断按GB/T16551-20082.3进行。5　常规病原学诊断试验5.1　对临床及病理学诊断的可疑患猪进行病原学诊断，实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行5.2　免疫酶染色试验按GB/T16551-20083.2进行。5.3　直接免疫荧光抗体试验按GB/T16551-20083.4进行。5.4　猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）按GB/T16551-200

4、83.5进行。5DB21/TXXXX—20111　复合荧光定量RT-PCR鉴别诊断试验1.1　引物和探针应用MegAlign软件对GenBank中公布的34株CSFV(包括23株国内外不同基因型的野毒株和11株弱毒疫苗株)和其它瘟病毒(包括BVDV-1,BVDV-2和BDV共4株)基因组序列进行比对分析，在高度保守的5'-UTR内设计了针对CSFV的通用上下游引物CSFV-F和CSFV-R(预期扩增产物大小为98-99bp)以及不同荧光基团标记的CSFV野毒特异性探针(CSFVw)和猪瘟兔化弱毒疫苗株特异性探针(CSFVv)(表1)，引物和探针由宝生物工程有限公司合成。表1　复合荧光定量RT-

5、PCR引物和探针序列及两端标记情况名称序列T值(℃)基因组位置(bp)CSFVF5'-GAACTGGGCTAGCCATG-3'57.0186-102CSFVR5'-ACTGTCCTGTACTCAGGAC-3'57.56166-184CSFVw5'-FAM-AGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCG-TAMARA-3'68.08111-137CSFVv5'-TET-TAGGACTAGCAAAACGGAGGGACTAGCCA-TAMARA-3'66.27110-138注：根据猪瘟病毒石门株(GenBankNo.AF092448)基因组位置。1.2　材料准备除特别说明外，本规范所用试剂均

6、为分析纯，本试验所用试剂需用无RNA酶污染的容器分装；各种离心管和带滤芯吸头需无RNA酶污染；剪刀、镊子和研钵器均宜经干烤灭菌。1.3　样品采集濒死猪、扑杀猪及流产胎儿取扁桃体、淋巴结、脾脏和肾脏；待检活猪，用注射器抽取猪血2mL～4mL。1.4　样品处理1.4.1　按1：5（质量浓度）比例，取待检组织和0.04mol/LPBS（pH7.2-pH7.4）液于研钵中充分研磨制成组织匀浆液，4℃1000g离心15min，取上清液转入无RNA酶污染的离心管中，备用。1.4.2　全血采用脱纤抗凝备用。1.4.3　细胞培养物冻融3次备用；其他样品酌情处理。1.4.4　制备的样品在2℃~8℃保存不应超过2

7、4h，长期保存应小分装后置-70℃以下，避免反复冻融。1.4.5　同时设阴、阳性样品对照。1.5　病毒RNA提取1.5.1　用Trizol试剂(MolecularResearchCenter,Inc.)提取样品总RNA。5DB21/TXXXX—20111.1.1　移取750μLTrizol至1.5mLEppendorf管，加入200μL血液（培养液或组织处理上清液），漩涡振荡20s，室温下作用5m