DB21∕T 1977-2012 水稻中转Bt基因成分PCR定性检测方法

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1、ICS65.020.60B21DB21辽宁省地方标准DB21/XXXXX—2012水稻中转Bt基因成分PCR定性检测方法ProtocolofthepolymerasechainreactionfordetectinggeneticallymodifiedcomponentsofBtgeneinriceXXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/XXXXX—2012目次前言II1　范围12　规范性引用文件13　术语、定义和缩略语14　原理15　试剂16　仪器27　抽样与制样38　操作步骤39　结果分析与表述

2、55DB21/XXXXX—2012前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省质量技术监督局提出并归口。本标准由沈阳农业大学、辽宁省标准化研究院负责起草。本标准主要起草人：崔震海、杨立宏、张立军、邱学思、徐正进、李丹莉、樊金娟、阮燕晔、姜宏、朱延姝、汪澈、曹松屹、秦萍。5DB21/XXXXX—2012水稻中转Bt基因成分PCR定性检测方法1　范围本标准规定了水稻中转Bt基因成分的PCR定性检测的原理、试剂、仪器、抽样与制作、操作步骤、结果分析和检测结论。本标准适用于转基因水稻及其衍生品种，以及制品中的转Bt基因成分的定

3、性PCR检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样的制样方法SN/T1943小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法SN/T2102.1食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义3　术语、定义和缩略语3.1　术语和定义SN/T1943的术语和定义适用于本标准。3.2　缩略语3.2.1　PCR:polymerasechainreaction

4、，聚合酶链式反应，简称PCR。3.2.2　RBE4gene：ricestarchbranchingenzyme4，淀粉分支酶基因。3.2.3　CaMV35S：35spromoterfromcauliflowermosaicvirus，来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。3.2.4　NOS：terminatorofnopalinesynthasegene，根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）Ti质粒胭脂碱合酶（nopalinesynthase）基因的终止子。3.2.5　5DB21/XXXXX—2012Btgene：Bac

5、illusthuringiensisgene，苏云金芽胞杆菌基因，简称Bt基因。包括cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ab/cry1Ac融合基因1　原理水稻样品经过DNA提取后，针对转Bt基因水稻中外源的CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因，以及内源的RBE4基因，设计特异性引物，通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增特异性DNA片段，判断水稻及其制品中是否含有转Bt基因成分。2　试剂除非另有说明，本方法试剂均为分析纯试剂和重蒸馏水。2.1　琼脂糖2.2　10mg/mL溴化乙锭（EB）溶液2.3　1mol/LTris-HCl溶

6、液(1000mL)称取121.1gTris溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至7.5，加水定容至1000mL。2.4　10mol/L氢氧化钠溶液(200mL)在160mL水中加入80g氢氧化钠，溶解后加水定容至200mL。2.5　0.5mol/LEDTA溶液(100mL)称取Na2EDTA·2H2O18.6g，加入70mL水中，再加入氢氧化钠溶液适量，加热溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液调pH至8.0，用水定容至100mL。2.6　CTAB提取缓冲液(1000mL)在600mL水中加入81.7g氯化钠，20gCTAB，充分溶解后加入1mo

7、l/LTris-HCl溶液100mL，0.5mol/LEDTA溶液40mL，用浓盐酸或氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容至1000mL，分装后高压灭菌。2.7　CTAB沉淀缓冲液(1000mL)在800mL水中加入2.3g氯化钠，5gCTAB，充分溶解后加水定容至1000mL，分装后高压灭菌。2.8　1.2mol/L氯化钠溶液(100mL)在60mL水中加入7.01g氯化钠，溶解后加水定容至100mL，高压灭菌。2.9　70%乙醇溶液(1000mL)取700mL无水乙醇，加水定容至1000mL。2.10　TE缓冲液(1000mL)在800m

8、L水中依次加入1mol/LTris-HCl溶液10mL，0.5mol/LEDTA溶液2mL，用浓盐酸或氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容至1000mL，分装后高温