斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

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1、斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库的构建及初步鉴定摘要：以健康未经免疫的斑点叉尾■为试验材料，取其新鲜外周血，分离淋巴细胞，提取总rna,逆转录合成cdnaoper扩增重链fd和轻链cdna,以纯化的vh、v1基因为模板，以与vh基因3'—端和v1基因一5'端序列互补的linker—primermix为引物，将vh>vl随机拼接为sCfvo通过酶切连接，依次将PCf产物插入质粒p3mh相应位点，热激法转化大肠杆菌x11—b1ue,加入辅助噬菌体vcsm13,构建噬菌体单链抗体库。测定库容并酶切鉴定。斑点叉尾■天然单链(scfV)噬菌体抗体库成功构建为进一步筛选特异性抗体及从斑点叉尾■病

2、变组织中提取特异性抗原用于免疫治疗奠定了基础。关键词：斑点叉尾・；抗体库；噬菌体展示；抗体单链(scfV)constructionandpreliminaryidentificationofsingle-chainantiboly1ibraryofnaturalphageinchannelcatfish,ietaluruspunetauswanghuil,zoushi-ping2(1.collegeoffisheries,huazhongagriculturaluniversity,wuhan430070,china；2.yangt刁eriverfisheriesreserchinstitu

3、te,Chineseacademyoffisherysciences,wuhan430223,china)abstract：peripheralblood1ymphocyteswereisolatedfrom250mlblood,whichwasobtainedfrom50non—immunnizedhealthychanne1catfishthroughtheirvenacauda1is•theychainandlightchainsynthesedfromthetotalrnacyteswereperamp1ifiedandeamplificationproductswercompact

4、edby1inker——primermxintoscfv•thentheamp1ificaonproductswere1igatedsuesive1yintothephagemidverp3mh,thenthe1igatedsamwastransformedintocompe11—b1ue•thetrancellswereinfectedwiperphagetcombinantphagescfvthesuccessfulconstnaivechanne1catfiseantibody1ibrarycreatedfavourab1econditionsforse1ectingspecificp

5、hageantibodyandabstractingspecificantigen.keywords：icta1uruspunctatusrafinesque；antibody1ibrary；bacteria1phage；scfv斑点叉尾・(ictaluruspunctatusrafinesque)亦称沟鲍(channe1catfish),属于绘形目(siluriformes)■科(ieta1uridae)鱼类。主要分布于美国中部、加拿大南部和大西洋沿岸的部分地区。斑点叉尾■是水产养殖业中最为重要的养殖鱼种之一，自20世纪80年代引进我国以来养殖规模不断扩大，出口量也在逐年上升。但是由于斑点

6、叉尾■种质资源退化严重，养殖技术较低，养殖环境恶化等原因，导致人工养殖的斑点叉尾■病害频发,给养殖业带来巨大损失。斑点叉尾■疾病防治应当坚持“预防为主,防重于治”的原则。噬菌体抗体是指采用基因克隆技术将b细胞全套可变区基因克隆出来，通过与噬菌体衣壳蛋白基因连接，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的抗体分子。用b淋巴细胞全套抗体可变区基因克隆并组装成的噬菌体群体称为噬菌体抗体库［1］。该技术克服了单克隆抗体杂交瘤细胞中抗体不稳定、容易丢失的弊端，直接利用抗原从抗体库中筛选特异性抗体［2-4］o本实验室采用未经免疫的健康斑点叉尾■外周血单个核细胞(Pbmc)为基因來源，建立斑点叉尾■天然单链(sc

7、fv)噬菌体抗体库。构建的主耍目的是为后期筛选抗原特异性抗体打下基础，筛选出的抗体主要用于斑点叉尾■疾病早期的抗体诊断试剂盒，从而更有效地对斑点叉尾■疾病进行防治。1材料与方法1・1材料淋巴细胞分离液购口上海超研生物科技有限公司；rn取纯化试剂trizol(bioflux)、逆转录试剂盒、taqdna聚合酶、dntp购自takara公司；t4dna连接酶购自promega公司；限制性内切酶spei、xhoi、