《基本实验技术》PPT课件.ppt

《《基本实验技术》PPT课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、基本实验技术二基因表达与调控三蛋白表达与功能分析一分子克隆四免疫组织化学五细胞功能实验六流式细胞技术一分子克隆分子克隆指按照人的意愿，在体外将某种生物的DNA片断插入到载体（质粒、病毒等）中，形成遗传物质的新组合---重组DNA分子（重组子），然后将重组子转移到宿主细胞中进行复制或表达，即对DNA分子进行克隆，以获得该DNA分子的大量拷贝。目的基因的获得目的基因与载体的连接重组DNA分子导入受体细胞筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆克隆基因、克隆基因的表达载体构建将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将重组质粒转入大

2、肠杆菌，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而克隆基因或表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。慢病毒载体（Lentiviralvector,LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒稳定细胞株构建转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。可通过转染干扰片段或过表达质粒，研究基因的作用。siRNA转染在一周内有效，需要马上进行功能实验。但转染效率受细胞类型及细胞状态影响，对于难以转染的细胞，建议用慢病毒构建稳定细胞株再进行后续实验，比如神经元细胞、干细胞。实时定量PCR(Real-TimeQu

3、antitativePolymeraseChainReaction)是在经典PCR技术基础上，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用特定仪器检测荧光信号积累的强弱，进而实时监测每一轮PCR反应产物，并对与其产物量呈正相关的初始模板进行定量分析的技术。二基因表达与调控•绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究•相对定量(RelativeQuantification，RQ)基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究引物设计RNA提取RNA逆转录QPCR检测数据处理染色质免疫共沉淀（ChromtinImmunoPrecip

4、itation，CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。研究DNA甲基化检测已知蛋白的靶基因组蛋白修饰染色质结构转录因子的协同结合CHIP实验技术流程图蛋白免疫印迹(WesternBlot)是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。该技术广泛应用

5、于检测蛋白水平的表达。三蛋白表达与功能分析四病理实验免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），进行定位及相对定量研究的一种技术。能将目地抗原的表位及表达量直观的呈现出来。免疫荧光(Immunofluorescence，IF)是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。可以采用不同激发波长的荧光二抗标记不同的目的蛋白，同时

6、观察两种蛋白的表达及共定位情况。TUNEL细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。是分子生物学与细胞形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确反映细胞凋亡的形态特征。原位杂交（ISH）基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核

7、酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。可确定组织中目的核酸的表达位置和表达量。IHCIFTUNEL五细胞功能实验细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。可用于研究与细胞增殖相关基因及细胞毒性实验等。细胞增殖检测MTS原理为淡黄色的物质被细胞生物还原为一种可溶性的有色产物，利用分光光度计检测490nm处吸光值来反应细胞的增殖与细胞活性。颜色越深，OD值越大，细胞相对数量越多，细胞相对活力越高。区别：M