病毒空斑纯化实验protocal.doc

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1、EV71空斑纯化实验protocal原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，接种的病毒液要充分分散和稀释。流程1.铺板将已长满80~90%RDcell消化均匀铺于6孔板中。2.病毒感染细胞长成单层达80~90%吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度，并向每孔中加入200μL稀释好的病毒液（阴性对照加DMEM200μL），置于37℃温箱吸附两小时后弃残

2、液。3.制备2%琼脂糖使用低熔点琼脂糖配方：0.2g加入10ml无菌PBS中，121℃高压灭菌15min，取出后置于55℃水浴锅中待用4.混合将上述琼脂糖和2X？维持液(FBS浓度为2%）40~50℃水浴1:1混合后，加入培养板各孔，每孔2ml,室温放置30min以上使其冷却凝固成覆盖层1.培养把培养板倒置？，在37℃二氧化碳培养箱继续培养48h。2.染色制备含0.2%结晶紫(生理盐水稀释）的2%琼脂糖：双倍维持液（1：1），置于40~50℃水浴待用，吸取上述混合液加入培养板各孔，每孔2ml,使冷却凝

3、固成第二覆盖层3.培养把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养48h观察，每皿蚀斑数量＜10个的稀释度中，挑选附近10mm均为健康的蚀斑。4.将挑选的病毒至少再传2代