低氧条件培养的PASMCs凋亡与p53表达变化.doc

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1、低孰条件培养的PASMCs凋亡与p53表达变化作者：彭利静李伟段永宏李[Abstract1AIM:Toobserveapoptosisandp53expressionchangesinhypoxiaculturedratpulmonaryarterialsmoothmusclecells(PASMCs)・METHODS:ThePASMCswereculturedprimar订ybytissueculturemethod.ThenumberofapoptoticcellswasmeasuredbyHoechststainingandflowcytometry.P53expr

2、essioninPASMCswasdemonstratedbyimmunofluorescenee(IF)stainingandobservedbyconfocalmicroscopy.RESULTS:Hoechststainingandflowcytometryshowedthatthenumberofapoptoticcellswasnotsignificafitlydifferentbetweencontrolgroupandhypoxic24hgroup.IFstainingshowedthattheexpressionintensityofp53wasincre

3、asedsignificantlyinhypoxic24hgroupthanincontrolgroup.CONCLUSION:IntheculturedPASMCs,hypoxiadoesnotenhancecel1apoptosis,butincreasesp53expression.【Keywords】anoxia;pulmonarya/rtery;muscle,smooth/cytology;genes,p53;apoptosis【摘要】目的：观察低氧条件下离体培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的凋亡和p53表达的变化.方法：采用组织块法原代培养人鼠PAS

4、MCs,应用Hoechst染色以及流式细胞术观察低氧对细胞凋亡的影响;采用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察P53在低氧条件培养的PASMCs中的表达变化.结果：正常条件下培养的PASMCs和低氧条件下培养的PASMCs的凋亡变化不人，荧光显微镜下凋亡细胞计数后亦未见有统计学差异.p53在培养的大鼠PASMCs中有少量表达，低氧刺激可使其表达增高(P<0.05).结论：低氧未能诱导离体培养的PASMCs凋亡增加，但可以诱导P53在培养的大鼠PASMCs中的表达增加.【关键词】缺氧；肺动脉；肌，平滑/细胞学；基因，p53；细胞凋亡0引言肺动脉高压(pulmonaryar

5、terialhypertension,PAH)是临床上常见的呼吸系统疾病，肺血管收缩和肺小血管结构重建是其发病的基本病理过程；目前研究认为，肺血管壁细胞增殖和凋亡的失衡是肺血管壁结构重建的重要原因[1-2]・p53是近年研究最为广泛和深入的肿瘤抑制基因之一，由于在慢性肺动脉高压的形成过程中，也有类似肿瘤细胞的过度增殖以及细胞凋亡的变化.因此，研究p53在肺动脉高压发生中的作用，对于了解肺动脉高压的发病机制，指导临床治疗有一定的积极作用.本研究我们采用组织块法原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonaryarterialsmoothmusclecells,PASMCs),

6、应用Hoechst染色以及流式细胞术观察低氧对细胞凋亡的影响，同时采用免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜观察P53表达的变化，了解p53在肺小血管结构重建中的作用.1材料和方法1.1材料雌雄不拘SD大鼠，体质量150〜180g（第四军医大学实验动物中心）;RPMI1640培养液（GIBC0公司）;新生牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所）；p53多克隆兔抗鼠TgG,FTTC标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；细胞凋亡Hoechst染色试剂盒（Beyotime生物公司）；三气培养箱（德国Heraeus公司）；激光扫描共聚焦显微镜MRC1024（美国BIORAD公司

7、）.1・2方法1.2.1大鼠卩ASMCs的分离及培养采用组织块法原代培养.健康大鼠用200g/L乌拉坦（4mL/kg）腹腔麻醉后打开胸腔，无菌操作分离肺动脉，剥离血管外膜组织，纵向剪开血管，刀片轻刮内膜，置于盛有2mL新鲜RPMI1640培养液（含有150mL/L小牛血清）的青霉素小瓶中，剪成约1mmX1mmX1mm大小组织块,均匀贴于25mL培养瓶底部,补加3mL培养液,盖好瓶盖并拧松半圈，将培养瓶底部向上放入C02孵箱.37°C,50mL/LC02,950mL/L02条件下孵育4h后，反转培养瓶.3~5d后，即可在镜下观察