医学论文浅析金黄色葡萄球菌β-溶血素.doc

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1、浅析金黄色葡萄球菌卜溶血素金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,金葡)是一种自然界中广泛存在的革兰阳性菌,可弓I起人和动物的局部化脓性感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎以及败血症、脓毒败血症等,同时也是造成人类食物中毒的常见致病菌之_。金葡菌主要通过产生多种致病因子而致病,这些致病因子包括溶血素、杀白细胞素、肠毒素、凝固酶、耐热核酸酶等。溶血素(hemolysins),又称细胞溶素(cytolysin),是由细菌分泌的能使细胞溶解的毒素,是金葡产生的一种重要毒力因子,包括a、久y

2、、54种。其中a、Y、5又称作打孔毒^(pore-formingtoxin)z即能跨细胞膜形成孔道,允许小分子和离子通过,从而使靶细胞代谢紊乱,最终裂解细胞。而「溶血素作用机制与其他3种均不同,因此被称之为非打孔毒素。B■溶血素(「hemolysins,Hlb),全长993bp,编码330个氨基酸z1-34位氨基酸(aa)为其信号肽,相对分子质量为35xl03o目前国内外对Hlb的硏究很少。已有研究表明,Hlb是一种鞘磷脂酶C,能特异性地水解鞘磷脂,Mg2+的存在能增强其生物活性。且HIb在体外

3、具有独特的溶血活性:热冷效应(Hot-cold)溶血特性”即Hlb在37°C作用于红细胞,红细胞不易裂解,随后置于4弋红细胞则能够迅速裂解。晶体结构表明,Hlb的第149位和287位的组氨酸(H)是其发挥生物学活性的关键性位点将149或287位的组氨酸(H)突变为天冬酰胺(N)时,Hlb的鞘磷脂酶活性降低。此外,Medora等还发现Hlb具有结合核酸的活性。本研究以金葡菌NCTC-8325为模板扩增得到Hlb的全长序列,并构建了野生型Hlb蛋白的重组表达载体利用点突变技术构建了突变体HlbH-1

4、49-N蛋白的重组表达载体,获得了Hlb及HlbH-149-N蛋白,验证其溶血活性,制备了Hlb的特异性抗体,并检测抗体的中和活性。1材料与方法1.1材料NCTC-8325菌株、原核表达载体pET-28a为本室保存;感受态DH5a及BL21(DE3)SHiFiTaq聚合酶、dNTP(北京康润诚业生物技术公司)。原核表达载体pMD・19T、限制性内切酶(NdeI.XhoIJaKa-Ra公司);质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司];细菌基因组DNA提取试剂盒(赛百盛公司)

5、;T4DNA连接酶、DNA聚合酶、Trans2KplusDNA标志物(北京全式金生物技术公司);低相对分子质量蛋白标准(上海生化所);NiSepharose6FastFlow纯化柱、CNBr-activatedSepharoseTM4B亲和树脂(GEHealthcare生物科学公司);绵羊血(芳元养殖场);anti・His(鼠源)单克隆抗体、HRP标记羊抗鼠IgG(中杉金桥公司);医用X线胶片[锐珂(厦门)医疗器材有限公司;SuperECL发光液(北京普利莱基因技术有限公司)。其他试剂为国产分析

6、纯—Uo1.2方法1.2.1Hlb重组蛋白的表达1.2.1.1引物的设计和合成PCR弓I物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,正向弓I物:5'-CGCGGCAGCATATGGAATCTAAGAAAGATGAT-3:反向弓

7、物S-CACCACCACTCGAGCTATTTACTATAGGCTTTGAB,划线部分为酶切位点。1.2.1.2pET-28a-hlb重组质粒的构建以金葡菌菌株NCTC-8325基因组为模板进行PCR扩增,PCR反应条mnT:94oC5min;94°C30s;60oC30s

8、;72°C60s;30个循环;72°C10min。扩增片段大小为891bpo将PCR扩增得到的hlb基因片段连接至PMD-19T,测序正确并利用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后,回收目的片段连入pET-28a载体,转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,经菌落PCR鉴定获得阳性克隆。1.2.1.3Hlb蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及纯化挑取阳性克隆于LB(Kana+,50pg/ml)培养基中37°C培养过夜,次日按1:100转接到新鲜的LB(Kana+,50pg/ml)培养基中37弋

9、培养至D600约为0.4时,加入诱导剂IPTG至终浓度为0.05mmol/L和葡萄糖至终浓度为0.25%,继续室温培养6h,4°C8000r/min离心15min收集菌体。用超声缓冲液(20mmol/LNa3PO4,0.5mol/LNaCI,20mmol/L咪呼,pH7.4)重悬菌体超声破碎菌体/TCHOOOr/min离心5min,收集沉淀和上清,通过SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白在上清中的表达,接着将上清经Ni2+亲和柱进行层析纯化,先后通过含20mmol/L咪哩浓度的洗涤液洗涤Ni2+柱,

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