叶酸脂质体包裹MYCN siRNA在裸鼠体内靶向治疗作用初步探究.doc

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1、叶酸脂质体包裹MYCNsiRNA在裸鼠体内靶向治疗作用初步探究［摘要］目的研究叶酸受体为靶向的脂质体包裹MYCN基因小干扰性RNA在神经母细胞瘤裸鼠骨髓、骨转移模型中的靶向性及治疗作用。方法16只成功建立神经母细胞瘤骨髓、骨转移模型的裸鼠，将其随机分为靶向性研究组（4只）和疗效性研究组（12只）。靶向性研究组裸鼠静脉给予CY3荧光标记叶酸脂质体包裹的MYCNsiRNA,荧光显微镜检测CY3在体内瘤组织及重要器官的荧光强度。疗效性研究组12只裸鼠随机分MYCNsiRNA组和无关siRNA组，静脉分别给予叶酸脂质体包裹的MYCNsiRNA与叶酸脂质体包裹的无关siRNA,采用荧光

2、定量PCR检测肿瘤组织MYCNmRNA表达，原位细胞凋亡检测法（TUNEL）观察肿瘤细胞凋亡数。结果CY3荧光标记的叶酸脂质体MYCNsiRNA给药8h后，荧光主要分布在肿瘤组织内，MYCNsiRNA组瘤组织中MYCNmRNA的表达量明显较无关siRNA组降低（P<0.05）,MYCNsiRNA组凋亡细胞数量高于无关siRNA组（P<0.05）。结论①叶酸脂质体MYCNsiRNA经静脉给药后主要靶向瘤组织，叶酸脂质体是肿瘤基因治疗的有效载体；②叶酸脂质体MYCNsiRNA在体内显著下调肿瘤MYCNmRNA的表达，促进肿瘤细胞凋亡，有望成为神经母细胞瘤治疗的新药物。［关键词］神

3、经母细胞瘤；MYCN；叶酸受体；脂质体；动物模型［中图分类号］R737.9［文献标识码］A［文章编号］1673-7210(2012)06(a)-0022-03神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤，占儿童肿瘤的7%〜10%。多数患儿就诊时肿瘤已转移，转移部位以淋巴结、骨髓及骨多见，在强烈化疗、自体造血干细胞移植及诱导治疗后，其预后仍然很差。目前广泛应用的化疗由于其缺乏特异性，对正常组织细胞毒副作用大，需要探索新的靶向治疗方法。20%〜25%神经母细胞瘤患儿有MYCN原癌基因扩增，大量研究显示，MYCN扩增提示疾病预后不良。因此，MYCN是治疗神经母细胞瘤的特异性分子靶点之一。R

4、NA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是近年发展起来的研究基因功能的实验技术，RNAi或基因沉默由小分子干扰核糖核酸(smallinterferingRNAs,siRNAs)介导，降解与其同源的mRNAo给予针对肿瘤细胞内的癌基因或促癌基因的siRNA药物以介导肿瘤细胞基因沉默，已成为肿瘤分子靶向治疗的热点。部分siRNA药物已进入I期临床试验，但仅限于肿瘤局部给药，如肿瘤内注射、眼内给药等。因siRNA全身给药有血流稳定性差和体内分布差的缺点，静脉应用仍停留在动物实验研究阶段。为了把siRNA定向地输送到肿瘤细胞，笔者选择脂质体作为载体，用纳米脂质体包裹s

5、iRNA,提高药物在体内的稳定性及靶向性，同时在其表面耦联叶酸分子，通过叶酸分子与肿瘤细胞表面叶酸受体特异性结合，实现主动靶向治疗。在体外实验中，笔者体外化学合成并筛选出针对MYCN基因的siRNA,应用叶酸脂质体包裹的MYCNsiRNA作用于神经母细胞瘤LA-N-5细胞，MYCN基因mRNA表达水平显著下降［1］。本实验仍以MYCN基因为靶点，研究叶酸脂质体包裹的MYCNsiRNA在裸鼠体内的靶向治疗作用。1材料与方法1.1细胞培养LA-N-5细胞用含15%胎牛血清的RPMI1640培养，置C02培养箱内，5%CO2,37€静置培养。造模当天用0.1%胰蛋白酶和0.1%ED

6、TA的混合溶液进行消化，无血清培养液调节细胞浓度至lX107/mL。1.2叶酸脂质体siRNA制备叶酸脂质体MYCNsiRNA及CY3标记的叶酸脂质体MYCNsiRNA均由美国俄亥俄州大学药学院RobertJLee教授合成惠赠。MYCNsiRNA序列为：正义链：5,-CGGAGAUGCUGCUUGAGAAdtdt-3；反义链：5’-UUCUCAAGCAGCAUCUCCGdtdt-3’o1.3实验动物分组及骨髓、骨转移模型的建立BALB/C裸鼠16只，雌性，4周龄，重15g左右，由解放军总医院动物实验中心提供，均在无特定病原体状态（SPF）条件下饲养于层流架内，饲料、饮水及垫料

7、均经高压灭菌处理，清洁水和饲料供小鼠自由摄入。裸鼠匀用10g/L戊巴比妥钠（75mg/kg）麻醉，右股骨及膝盖皮肤用碘伏消毒。从股骨末远端皮肤做一小侧切口（8〜10mm）,沿筋膜钝性分离股骨侧面肌肉，用镶子固定暴露的股骨下段。用26G的无菌针从離骨上、两股骨髒间钻过骨质进入骨髓腔。然后取出无菌注射针，换Humilton注射器的穿刺针，插入骨髓腔直到进入股骨近端干聽端。缓慢注射入人神经母细胞瘤LA-N-5细胞悬液5UL,约1X105个肿瘤细胞，然后缓慢拔出针头，后用骨蜡封闭针孔缝合皮肤伤口。待裸鼠苏醒后回