举例论述酶分子结构研究技术在蛋白质工程领域的应用.doc

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1、蛋白质工程与酶工程期中作业学院：生命科学与技术学院班级：08级生物技术01班学号：200813050321姓名：黄艳苹上课时段：周一9、10、111。举例论述酶分子结构研究技术在蛋白质工程领域的应用如果把酶工程看做是现代生物工程学研究与开发的厉史长河中的第一浪，那么蛋白质工程就是第二浪了。　酶工程最初是指自然酶制剂在工业上的大规模应用，它是根据酶学的基本原理与化学工程技术相结合的产物。近二十年来，由于基因工程和蛋白质工程等新兴高科技的发展，酶工程又和其相互渗透，构建有经济价值的工程酶、突变酶，大大促进了酶工程的发展。1突变体酶对蛋白质的影响如今在任何一个蛋白质或酶的研究中，突变位点的选

2、择往往是在晶体结构模型基础上，借鉴已有的蛋白质结构与功能研究知识而提出来的，并在普遍性原则中，寻找特殊性和突破点。例如，获得提高热稳定性的突变体，往往考虑改变亚基间静电相互作用强度改变邻近残基间氢键数目替换易被氧化、去氨基化和化学修饰的残基减少蛋白质从伸展到折叠过程中的自由能等等。为此，国外实验室及我们课题组对的突变选择提出过几百个可能性，但真正获得性质改善的酶的报道不多，典型例子如下等人在试图通过蛋白质工程提高密苏里游动放线菌热稳定性研究中叫，首先考虑是酶的不可逆热变性过程最终导致四聚体分子解离成无活性的亚基。而根本原因是反应溶液中的糖分子通常与结构中的残基的。一氨基发生希夫碱反应，

3、这种非酶糖聚化应该是影响酶热稳定性的重要原因。将二聚体表面的突变为，不仅抵抗了化学修饰，而且还与产生一个新的氢键，突变体酶活是野生型的，虽然℃下的半衰期只是从小时增加至小时，但它在葡萄糖中℃下的半衰期增加了五倍。另一个三点定位突变、和的工程酶的活性是野生型的写，热稳定性高于野生型，甚至也高于。同样是对密苏里游动放线菌的研究，等人的突变体明显改变了酶作用的最适值二。野生型酶进行木糖异构化反应的最适在存在时是，在条件下为，而在相同条件下最适为。另外，与野型酶在“十作用时的活性相比，要高出两倍。美国公司几年前曾对大肠杆菌进行了盒式突变，筛选到了二个活性大于野生型的突变体酶二，其中图标注为准突

4、变体即使在仁，低于的条件下，催化速率仍高于野生型的两倍。而英国帝国理工学院的研究组在通过蛋白质工程提高节杆菌的热稳定性研究中口，并没有得到预期的结果。为了加强亚基间相互作用，以减少酶分子解聚成二聚体和单体，他们通过对亚基接触面之间结构的细致研究和分子模拟，提出了个位点的个突变方案①②③和④十，其中，前三个突变是在一’或一’之间引人一个或二个二硫键。对突变体酶分析结果显示，与野生型相比，除突变酶的热稳定性包括在尿素存在条件下明显降低外，它们的活性和稳定性没有明显改变。进一步的“一沙一的一射线晶体衍射和酶动力学研究表明，这一负结果主要是由人二硫键后引起了和残基的构象发生改变，进而妨碍了金属

5、离子结合于位点引起的。我们相信，随着酶晶体学和分子动力学以及计算机模拟方法的发展结构和功能关系研究的深人一定能够获得更多更好的突变体酶，同时也能够丰富和发展蛋白质工程知识库2枯草杆菌碱性蛋白酶和链霉菌葡萄糖异构酶的蛋白质工程。结合国内外蛋白质工程是80年代创立的高新技术，它可以按照人们的需要，根据蛋白质(含酶蛋白)结构与功能的关系，把天然蛋白质定向改造为具有特殊优良性能的突变体蛋白质，或者从头设计全新的蛋白质。例如枯草杆菌碱性蛋白酶和链霉菌葡萄糖异构酶的蛋白质工程。已经克隆了这两个酶的基因，并完成了酶基因的定位突变。例如将蛋白酶分子中222位甲硫氨酸的密码子通过定位突变改变为丙氨酸，可

6、以提高蛋白酶对洗涤剂中氧化剂的抗性。葡萄糖异构酶(又称木糖异构酶)247位的甘氨酸改变为天冬氨酸，突变酶的反应最适pH比野生型下降016pH单位；但突变酶的热稳定性较野生型差；如将该酶138位的甘氨酸改变为脯氨酸，突变酶的最适反应温度比野生型提高10℃；进一步通过定位突变使酶分子产生双点突变(Gly138vPro，Gly247vAsp)，突变酶的最适pH下降，催化活力为野生型的115倍，突变酶降低了反应pH，提高热稳定性，更有利于酶的工业化应用。目前正在将突变酶的基因进一步克隆到有工业应用价值的菌株中高表达，经过一段时间的努力，可望在我省实现将蛋白质工程的高科技成果转化为生产力。3木糖

7、异构酶的蛋白质工程从天然菌株分离纯化得到的野生型早已商业化，如以淀粉生产高果糖浆取得了巨大经济和社会效益，但也存在一定的局限性。主要表现在在较高的反应温度下稳定性还不够理想，而异构化反应时，温度越高直至℃一℃，热力学平衡越趋于果糖方向。〕最适为偏碱性，在高温碱性条件下，果糖稳定性较差，会有褐色反应，同时还伴有经甲基糠醛等毒副产物生成〕二价金属离子，如，等，对的活性有抑制作用，而“十恰是果糖生产中另外两个酶淀粉酶和糖化酶的激活剂。因此，通过蛋白质