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时间:2020-03-13
《病毒空斑纯化步骤.doc》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、猪流行性腹泻病毒(PEDV)纯化分离方案(1)将已准备好的VERO细胞消化均匀铺于6孔板中。(2)细胞长成单层后吸去培养液,将病毒做10倍稀释,共做5个梯度并向每孔滴加0.4ml稀释好的病毒液,置37℃吸附2小时后弃残液。(3)制备2%的琼脂糖(PCR电泳胶一样的琼脂糖),置40-50℃水浴待用。101102103104105阴性对照(4)将上述琼脂糖和双倍维持液(1:1)混合后,加入培养板各孔,每孔2ml,使冷却凝固成覆盖层。(5)把培养板倒置,在37℃二氧化碳培养箱培养48h。(6)制备含0.002%中性红的2%琼脂糖:双倍维持液(1:1
2、),置40-50℃水浴待用。(7)吸取上述琼脂加入培养板各孔,每孔2ml,使冷却凝固成第二覆盖层。(8)把培养板倒置,在37℃二氧化碳培养箱继续培养,48小时内观察结果。(9)挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。主要问题:1、铺完琼脂糖层之后,24h之后细胞轮廓模糊,不清晰。48h之后有些孔的细胞基本上看不清了,但是这都不是病毒造成的。(支原体的存在会不会导致这种情况)2、使用中性红染色在一开始就染色还是等病毒造成一定的噬斑再染色,覆盖一层还是两层琼脂糖层?3、使用的琼脂糖是不是有问题,与琼脂区别大不大?4、之前按照这个方法加了中性红的
3、琼脂糖层之后,细胞着色很不理想。看不出明显的染色区域,只是有些红色的点点。5、温度不会出现问题,因为把握的很好,细胞不会被烫死的。就是不知道自己配制的液会不会由于渗透压的原因导致细胞死亡。6、一直拿不出照片的原因就是没法看到空斑,板孔中不能显示出一个一个比较像样的噬斑,我挑也是挑病变情况有点不一样的病灶。
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