基因工程10基因组研究技术.ppt

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1、第十二章基因组研究技术基因组研究技术的核心内容：从不同层次上对基因组全部或某一区段遗传信息的有序性排列方式以及它们对应功能的揭示。第一节基因组遗传图谱的构建遗传作图（geneticmapping）：对某个未知真核生物基因组中的遗传信息（或是控制某个性状的基因）在染色体上的位置和分布状况进行初步确定。它是采用遗传学分析方法将基因或其他DNA序列标定在染色体上使之成为一条条有标识的“公路”。经典遗传图谱人们把单倍体配子所有染色体上的全部基因称为一个基因组。基因组内每条染色体上的连锁基因称为一个连锁群。绘制遗传图谱就是要进行每条染色

2、体上基因座位的顺序和距离的确定，即主要通过家系分析，对不同性状之间、性状与标记之间、标记与标记之间的连锁遗传频率进行计算，最终绘制遗传连锁图。人类遗传图谱包括女性一种配子的23条染色体(记作23，X)和男性两种配子的23条染色体(23，X)、(23，Y)上的所有基因位点。现代遗传图谱70年代发展起来的DNA重组技术、DNA克隆技术和DNA探针技术无疑为拓展遗传图谱的构建途径创造了技术条件，也使人类基因定位的方法从细胞及染色体水平过渡到分子水平。DNA水平的多态性标记位点作为绘制现代遗传图谱的主要界标，大大提高图谱的精确度、准确

3、性。遗传图谱的绘制也因此进入了一个崭新的时代。现代遗传图谱的概念是由BotsteinD等(1980)首先提出的，在此基础上，限制性片段长度多态性RFLP作为遗传图谱的第一代崭新标记得以问世。遗传图谱的第二代标记位点是大量的可变数量串联重复（VNTR)，包括微、小卫星(MS)或短串联重复(STR或SSLP)。第三代标记是位点极其丰富的单核苷酸多态性(SNP)。一、遗传作图标记凡是位于染色体上易于检测识别、在不同个体之间存在变异而且可以稳定遗传的位点都可以作为遗传作图的标记。形态标记分子标记遗传作图标记形态标记在经典遗传学中，每个

4、相对性状都由一个不同的等位基因（allele）控制。但这些可见的表型性状十分有限，当多个基因影响同一个性状时，精细的遗传作图分析则陷入困境。因此，要构建高分辨率的遗传图，就必须有数量极其丰富的遗传标记。每一段具有专一遗传性状和功能的DNA被称为基因。一对染色体中两条染色单体上相同位置的DNA片段，就是一对等位基因。每对等位基因的性状有显性和隐性之分。拟等位基因(pseudoalleles)：表型效应相似,功能密切相关,在染色体上的位置又紧密连锁的基因。它们象是等位基因,而实际不是等位基因。分子遗传标记（DNA标记）凡是满足遗传

5、标记特征的一段DNA序列都可以被发展成为DNA标记，DNA标记所在的遗传位点必须有不同等位基因，特定个体相应的基因型可以通过实验手段很容易检测出来。由于DNA标记类型丰富，数量众多，因而已经成为遗传作图的主要工具。分子遗传标记是指利用分子生物学的方法来区分不同的个体或群体,并且可以稳定遗传的物质或性状,是生物个体或群体间遗传差异的客观表征。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）定义：就是用限制性内切酶降

6、解从生物中提取的总DNA，经凝胶电泳分离这些降解的小片段，再通过southern印迹转移到滤膜上，然后用放射性标记的探针与滤膜上的DNA杂交，洗去多余的杂交探针，永久性滤膜经放射性自显影就可发现与探针杂交的DNA限制性片段。不同的限制性内切酶，不同来源的DNA及标记的探针就会有不同的结果组合，利用这些不同的组合就可以构建RFLP分子标记图谱。简单地说就是DNA经限制性酶切后产生的DNA片段组成状态，涉及片段的多少和大小。对不同的物种来说，相当于形成了由DNA片段多态性组成的指纹。RFLP是第一种被用于作图研究的DNA标记。用R

7、FLP进行基因定位原理：EcoRI例：－GAATTC－切点减少－GAGTTC－－CTTAAG－切点增加－CTCAAG－mRNA:GAAGAG　谷aa谷aa优点：高效、可靠、可在一个反应内检测大量的限制性片段；缺点：需用同位素或非同位素标记引物，较费时、耗材而且单个探针位点少，鉴别效率不高。ABAB限制性内切酶位点与放射性探针结合部位①限制性内切酶酶切后；②电泳分离DNA片段；③转移至硝酸纤维素薄膜；④与放射性探针杂交，⑤分析阳性条带简单序列长度多态性(simplesequencelengthpolymorphism,SSL

8、P）产生于重复顺序的可变排列，同一位点重复顺序的重复次数不同表现出ＤＮＡ序列的长度变化。小卫星序列：重复单位的长度为数十个核苷酸。微卫星序列：重复单位的长度为1～6个核苷酸，有10～50个重复单位串联组成。分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。目前微卫星D