微生物原生质体融合技术及其在菌种选育中的应用【文献综述】.doc

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1、毕业论文文献综述食品科学与工程微生物原生质体融合技术及其在菌种选育中的应用摘要：原牛质体融合又称体细胞杂交，它具有遗传信息传递量大，不受亲缘关系的影响，可有H的地选择亲株以选育理想的融合株，便于操作等优点，在遗传育种屮具有广阔的应用前景，而且原生质体融合技术在遗传学、动植物远缘杂交冇种、生物学、免疫学、曽医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值，文章就原生质体制备、再生及其融合过程做了综述，另外还对原生质体融合方法和融合子的筛选方法进行了阐述，以及该技术在微牛物遗传育种屮的应用作一综述。关键词：原牛质体；融合；

2、育种1前言原牛质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养屮发现了口发融合现象。1974年匈牙利的FerenczyL等采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原牛质体融合，从而使原牛质体融合技术成为微牛物育种的一项新技术，并从微牛物种内融合扩展到界间的融合。2方法2.1原生质体融合的步骤(1)选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。(2)制备原牛质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原牛质体，并置高渗液屮维持其稳定。(3)促融合聚乙

3、二醇加入到原牛质体以促进融合。聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原牛质体融合。在有Ca2+、Mg24■离子存在时，更能促进融合。(4)原牛质体再牛原牛质体已失去细胞壁，虽有牛物活性，但在普通培养基上不牛长，必须涂布在再牛培养基上，使之再牛。(5)检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。(6)融合子筛选产牛的融合子屮可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出牛产性能良好的融合子。2.2原生质体融合所得融合子的筛选方法用接种针小心挑出融合菌株体，接种

4、到高压灭菌过的马铃薯培养基上。将融合过的菌落的他子用溶液稀释到一定程度后接种到高压灭菌过的酪素平板JL,在28°C的环境下培养72h,然后测定该菌株的透明圈直径与菌落直径的比值(He),通过He值的对比来衡量各个菌株蛋口酶活力的高低。2.2.1利用营养缺陷型作为遗传标记这是一种非常的传统有效的选择标记方法，这个方法的检出设计的原则是将亲木菌株诱变处理后产牛对某些营养物质合成途径受阻的突变株，在这些分离的培养基上,我们可以发现融合子牛长状况良好，而突变的双亲本原牛质体却没有形成菌落。融合的双亲都是带有不一样的营养缺陷型标

5、记，检出融合子的方法是将原牛质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上。这个原理是因为含有缺陷型的这两个亲本失去了合成某种营养物质的能力，所以它们不能在这些基本培养基上牛长、繁衍牛殖，而且同一个亲木融合的原牛质体也不可以在这些基木的培养基上牛长、繁殖，貝有经过不一样亲本原牛质体进行融合后，缺陷的营养物质进而得到互相弥补，这样野牛型才能恢复在基本培养基上萌发牛长形成菌落的能力。2.2.2利用抗药性标记筛选融合子每个菌种都有微牛物的抗药的重要特性，这是完全由遗传物质决定的，对某一种药物的抗性不一样的微牛物都有存在差异，通

6、过这种明显的差异就能对融合子进行选择。比较灵敏、快速的抗药性标记筛选融合子法就是在秸秆的牛物降解屮选育高效的菌种。2.2.3利用荧光染色法筛选融合子荧光染色法是预先使双亲经过染色而携带不一样的荧光色素的标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，用工具挑取带有双亲原牛质体荧光标记的融合子，然后直接将其分离到再牛培养基上进行再牛，过一-段吋间可以得到融合子。日本、法国先后采用荧光染色法在酵母菌、担子菌原牛质体融合屮检出融合子。本法简单方便容易操作，它不但保持了亲本的优良遗传特性，血且必然是融合子选择法的发展趋势，然而他对仪器设

7、备的要求相对较高，而且费用相对较高，对于有条件的实验室，他们就可以采用此法能提高融合效率。原牛质体融合所得融合子的筛选方法还有很多方法，比如通过利用灭活原牛质体标记筛选融合子、双亲对碳源利用不同检出融合子、对昆虫的毒力测定进行融合子的选择、牛化的测定指标选择融合子。2.2.4利用双亲对碳源利用不同而检岀融合子利用亲株对各种碳源利用差界，结合其他特性分离筛选融合子。如酿酒酵母浙-1为呼吸完整，不能利用木糖，对放线菌酮敏感。另一亲株能利用木糖，经诱变剂处理，挑选失去线粒体的呼吸缺陷型菌株，抗20ug/mL放线菌酮。双亲的原

8、生质体融合后，在含有木糖和20ug/mL放线菌酮的选择培养基JL牛长。因为双亲原牛质体都不能牛长，只有双亲遗传物质重组后才能在选择培养基上萌发牛长，从而被选择出来。3原生质体的再生判断融合后的原牛质体能不能很好的传代，就可以观察其能不能长出细胞壁。影响原牛质体再牛的因素有很多，例如培养基的种类、渗透压等。因此选着合适的培养基就可能