细胞工程第五章 植物细胞培养技术ppt 植物细胞培养技术第1-2节.ppt

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1、第五章植物细胞培养技术1植物的单细胞分离及培养植物细胞的悬浮培养植物细胞的规模培养植物细胞培养的应用本章主要内容2知识目标掌握植物的单细胞分离方法掌握植物的单细胞培养方法植物细胞规模培养技术要点掌握植物细胞悬浮系的建立以及种细胞的筛选方法。了解植物细胞悬浮培养生物反应器主要类型及其特点了解提高细胞次生代谢产物的途径3能力目标会分离植物单细胞（详见实验实训指导）。会培养植物单细胞（详见实验实训指导）。4能力目标会分离植物单细胞（详见实验实训指导）。会培养植物单细胞（详见实验实训指导）。第一节　植物单细胞的分离单细胞的分离通常主要采用机械法;酶解法;愈伤组织分散法等。5一、由植

2、物器官分离单细胞要从完整植物器官中分离单细胞，通常主要采用机械法和酶解法等。叶片是分离单细胞的最好材料。61、由完整的植物器官分离单细胞机械法酶解法叶片是分离单细胞的最好材料7⑴机械法Ball&Joshi(1965)、Noggle(1967)、Joshi&Ball(1968)研究者和时间：研究材料：花生成熟叶片第一种方法：用刀片刮叶片8具体方法撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞9第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心10只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。11⑵酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以

3、分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心12机械法和酶解法比较机械法酶解法细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离；细胞产量低；细胞易破。细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。13注意：大麦，小麦和玉米，很难通过酶解法使细胞分离。（叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间链状互锁结构）14二、由愈伤组织分离单细胞这是用愈伤组织分离获得游离单细胞的方法。它是将园艺植物的器官或组织采用一般的组织培养方法诱导愈伤组织，把产生的愈伤组织继代培养，然后将继代培养的愈伤组织置于悬浮培养液中。可加少量纤维素酶和果胶酶以促使愈伤组织离散，还可用搅拌．振荡等方法加速其离散。最后，将这种悬浮液

4、用一定规格的细胞筛去除未分散的愈伤组织和较大的细胞团，这样剩下的游离细胞和较小细胞团的悬浮液即可作为接种液。15主要步骤：1诱导产生愈伤组织；2愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；3将这种悬浮液用一定规格的细胞筛去除未分散的愈伤组织和较大的细胞团，这样剩下的游离细胞和较小细胞团的悬浮液即可作为接种液。16二、由愈伤组织分离单细胞茎段诱导17步骤：摇床用于振荡继代悬浮将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物18优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。19第二节单细胞培养技术本节主要介绍植物单细胞培养的意义、培养方法、影响因素和注意

5、事项。20一、植物单细胞培养的意义1．建立单细胞无性系；2．排除体细胞的干扰，有利于对细胞活动跟踪观察；3．培养用于无性繁殖，大大提高繁殖速度；4.用于生物科学研究；5.有目的的改造园艺植物种质资源。21二、单细胞培养的方法单细胞培养的方法有液体浅层培养；微室培养（微滴培养）；平板培养；看护培养；悬浮培养等。22（一）液体浅层培养1．概念：液体浅层培养是指先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右，石蜡膜封口，静置培养。2．液体浅层培养法特点：优点：培养物与空气接触面大，有利于气体交换，通气性好；细胞代谢产物容易扩散，有利于有毒物质的

6、扩散，不会造成有害物质的危害；继代培养方便．便于观察。缺点：由于细胞可以游动，不能进行定点观察单细胞生长．分裂后，难以得到单细胞系。231、液体浅层培养法将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单细胞和小细胞团培养在浅层液体培养基中液体培养基用途：主要用来增殖细胞。24特点：有利于有毒物质的扩散；有利于气体交换；不利于定点观察；单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系。25（二）微室培养（微滴培养）（40-100μl）1．概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，即将细胞培养在很少量的培养基中，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。26薄层培养微室制作示意图27

7、微室培养（Microculture）图示：1滴含单细胞培养液周围加石蜡油凹穴载玻片旁边加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片平视图置培养皿中26~28℃恒温培养284-2微室培养特点：在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。4-3微室培养要求：（1）微室内不能有气泡。（2）最好微室的厚度不要超过20微米，盖玻片的厚度要在0.17~0.18毫米左右。（3）观察时要保持温度和培养时的一致。29（三）平板培养1．概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左