核酸扩增检测实验室环境污染的监测.pdf

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1、·实验室检测·性病核酸扩增检测实验室环境污染利蚴!f中国疾病预防控制中心性病控制中心施美琴戴秀芹孙秀峰尹跃平209摘要目的为保证聚合酶链反应(PcR)实验结果的准确、可靠，对PcR实验室各区域是否存在污染进行监潮。方法使用实验室常规检洲病原体淋球茵(NG)和沙眼衣原体(CT)DNA检潮．对PCR实验室四个区域使用的实验台、离心机、冰箱、移液器等仪器设备共计22个部位每月一次进行检潮。结果共检测36次，一区、二区CT、NG检测全部为阴性，表明未发生污染，三区拭子④、四区拭子⑤⑥的NG检测结果有4次为不确定。经复检后都为阴性。

2、四区拭子⑤⑥CT、NG检测结果合计有11次为抑削，其他均为阴性，对其中的7次进行复检，5次为阴性，2次复检后蛄果为抑制。结论每月一次检测可有效监测PCR实验室是否存在污染。以便夏时采取措施消除污粢潭。关键词聚合酶链反应；沙眼衣原体；琳球茸；环境监测；污染聚合酶链反应(PCR)具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点，目前已广泛应用于临床检测工作，由于存在假阳性和假阴性的问题所以该方法在实际使用中有一定的局限性⋯1。由于PCR技术的高度敏感性，在体外具有很高的扩增效率，故在实验过程中从样本制备到结果产生的每个环节如处理不当将会

3、造成实验室污染，导致假阳性结果【2】，所以预防和控制污染尤其重要。为了有效监测实验室是否发生污染，我们在日常工作中每月一次对PCR实验室四个区域的环境、仪器、使用的物品等进行检测，以达到环境污染监测的目的，现将结果报告如下：1．材料和方法：1．1实验方法：实验室常规检测病原体CT、NGDNA的检测方法，使用美国罗氏公司生产的Ampli．cationCT／NGTest双检试剂盒，试剂盒具有内对照系统及含尿嘧啶糖苷酶的AmpEmse防污染系统，实验操作严格按照试剂盒的说明书要求进行。1．2采样方法：在2mLEppendoff管

4、中加入lmL无菌去离子水，使用无菌人造纤维采样拭子，蘸取去离子水，分别对需要取样的部位进行滚动式采样，将已采样的拭子放入拭管内，反复涮洗，沿管壁尽量将拭子挤干，弃拭子，将拭子洗脱液用于CT、NG的DAN检测。1．3采样部位：分别用6个拭子对PCR实验室四个区域内的仪器设备等22个部位进行采样，其中拭子①取一区实验台面、超净工作台台面、冰箱门把手、加样器表面，拭子②取二区中不同量的加样器表面(共4把)，拭子③取二区中实验台面、生物安全柜台面、冰箱门把手、孵箱内壁、离心机内孔，拭子④取三区实验台面、PCR扩增仪内孔，拭子⑤取四

5、区加样器表面、通风柜台面、冰箱门把手、洗板机表面，拭子⑥取四区实验台面、孵箱内壁、酶标仪检测面。1．4结果判断标准：CT判断标准：阳性：OD值≥0．8。阴性：OD值<0．2。不确定(灰区)：0．8>OD值≥0．2，需对样本重新进行双管检测。以3次结果中2次结果为最终判定结果；NG判断标准：阳性：OD值≥2．5。阴性：OD值<0．2。不确定：2．5>OD值30．2，需对样本重新进行双管检测，以3次结果中2次结果为最终判定结果；抑制(假阴性)：内对照(ic)OD值<0．2，CT、NG结果都是阴性，表明样本为假阴性，需对原样本进

6、行10倍稀释再进行检测，如再次出现假阴性视为无效结果，需重新采样；6个拭子中如有检测结果阳性，需对其采样的部位分别重新采样并进行检测，以确定哪个部位发生污染，如结果为阴性即该拭子所采样的部位均判阴性。1．5PCR实验室清洁消毒方法：每次实验前将各区用紫外灯消毒0．5小时以上，实验结束后将使用物品和实验台面等用10％(v／v)次氯酸钠擦拭清洁后再用70％的乙醇擦拭清洁，实验室用紫外灯消毒4小时以上。2．结果：36次检测，一区、二区CT、NG检测全部为阴性，三区拭子④、四区拭子⑤⑥的NG检测结果有4次为不确定，其他均为阴性。不

7、确定样本经复检后均为阴性。四区拭子⑤CT、NG检测结果有8次为抑制，抑制率为22．2％，其他均为阴性，抑制样本中有4次复检后为阴性，3次未进行复检，1次复检后为抑制，表明样本为无效结果，拭子⑥CT、NG检测结果3次为抑制，抑制率8．33％，其中有1次复检后为阴性，1次未进行复检，1次复检后抑制，表明样本为210无效结果，检测结果显示除4份样本未进行复检和结果。(见表1)。2份样本为无效结果外，连续36次检测未出现污染裹lPCR实验窒各区域CT、NG环境污染检测结果·实验室检测-备注：-有部分样本未进行复检或复检后结果为抑制

8、3．讨论引起PCR实验室污染的的主要污瓤源有：标本问的交叉污染(如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本)、PCR试剂的污染(储存液或工作液)、PCR扩增产物的污染和实验中克隆质粒的污染等。由于PCR方法的敏感性和特异性较高，在体外能扩增出大量的DNA产物，PCR扩增产物会污染实验视中的试剂、仪器设备