转氨酶实验前讨论.ppt

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1、谷丙转氨酶的测定（改良赖氏法）谷-丙转氨酶（ALT），催化丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min，Mohun法和Reiman法30min。King法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下与底物作用60min，生成1μmol丙酮酸称为一个单位。Mohun法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作用30min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位

2、。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位。1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位=0.4821IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。简便，但-酮戊二酸的干扰使得实验设计上对总体思路的彻底达成有一定难度。还原辅酶I在340nm

3、处有最大光吸收，因此伴随还原辅酶I不断被氧化，340光吸收值随之下降，下降速率和ALT活力成比例，籍此测定ALT活力。特异性、精确度高但，实验条件要求高连续监测(速率)法测定比色法原理：速率法原理：两种方法各有很强的优势与不足，而他们测定的是同一个体系，可否巧妙的取长补短？改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，所测酶活性数据可信度大为提高。实验改动及数据处理注意：1、以蒸馏水（dH2O）确定722分光光

4、度计的100%T，然后测定所有实验数据。2、数据整理：标准曲线各点所获OD值减去丙酮酸含量为零管的OD值，对应各自丙酮酸含量。3、标准曲线：以丙酮酸含量为横坐标，以上述求差后的OD值为纵坐标，按比色法原理要求作图。4、丙酮酸含量与卡门氏单位的回归分析：以丙酮酸含量和其对应的卡门氏单位，分析两组数据之间的相关性（可作图辅助自己判断），利用计算机求算最佳线性拟合，由R方（决定系数）判断，大于0.999，获得回归方程。5、样品结果计算：由丙酮酸-OD520标准曲线求得丙酮酸含量，带入丙酮酸含量与卡门氏单位线性回归方程，求得对应的卡门氏

5、单位。注意样品各自的稀释倍数。