2011分子生物学研究方法总复习温习(刘剑老师).pdf.ppt

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1、分子生物学研究方法刘剑2.限制性核酸内切酶的命名原则1973年，1980年进行了系统分类①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名;第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名。②第四个字母代表宿主菌的株系或型。③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。限制性核酸内切酶的命名原则：属名种名株名Haemophilusinfluenzaed流感嗜血杆菌d株HindⅡHindⅢ同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶4.Ⅱ型限制性核酸内切酶的功能Ⅱ型限制性核酸内切酶

2、有严格的识别、切割顺序，识别序列一般为4～8个碱基对，具有回文结构。它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。EcoRⅠ的识别序列5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG5’６.Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性指由于反应条件改变，酶切的核酸序列不同于它特定的识别序列,即酶切反应的特异性发生了改变。5.2.2DNA分子的连接（运用DNA连接酶进行连接）DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′-磷酸根和3′-羟基生成磷酸二酯键。这种反应

3、需要能量。大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致遗传性状特征发生改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。5.2.3细菌转化5.2.3核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA片段的凝胶电泳技术，已经发展成

4、为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的分子生物学研究方法。在一般情况下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。大分子量的DNA移动的慢小分子量的DNA移动的快电泳缓冲液阳极阴极DNA加样孔2.4.PCR(聚合酶链式反应)及其应用概念：在引物指导下由酶催化的对特定DNA序列进行的体外扩增反应。由多个循环组成。每个循环包括了变性、退火以及延伸三个阶段。PCR循环

5、–第一步–加热变性靶序列靶序列PCR循环-第二步–引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase第1个PCR循环完成后–得到两个拷贝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin①引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右②引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段③引物碱基：A

6、TGC最好随机分布④避免引物内部及引物间出现二级结构：特别是3`端⑤引物3`端的碱基要求严格配对：特别是最末及倒数第二个碱基⑥引物中可以加上合适的酶切位点：要作酶切时用⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性三、引物设计原则标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物　　　　　各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L四、PCR反应体系5.3基因克隆技术基因克隆（分子克隆molecularcloning）----通过体外重组技术,

7、将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体,并导入受体细胞，进行DNA分子扩增、筛选、鉴定等的过程。具体流程（一）目的基因的获取（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接（四）重组DNA导入受体菌（五）重组体的筛选（一）目的基因的获取1.化学合成法2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)或RT-PCR4.分离克隆差别表达的基因分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。将重点讲述分子克隆载体的特点;常见分子克隆载体

8、;分子克隆载体总述１、载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制扩增能力２、载体特点至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2.至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。3.至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞多克隆位点ori复制起始点遗传标记