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1、Thl7细胞在小鼠H22原位肝癌模型中表达与意义［摘要］目的检测小鼠原位肝癌模型中Thl7细胞的表达，探讨其在肝癌免疫中的作用。方法30只Balb/C小鼠随机分为肝癌模型组（10只）、生理盐水对照组（10只）、空白对照组（10只），流式细胞术检测小鼠分离纯化后的各组新鲜脾脏Thl7细胞的相对比例；实时RT-PCR检测各组肝组织IL-17基因和RORyT基因表达水平。结果肝癌模型组脾脏Th17/CD4+T细胞的比例高于生理盐水对照组脾脏、空白对照组脾脏，差异有统计学意义（P0.05）。肝癌模型组肿瘤组织IL-17mRNA和RORyTm
2、RNA的表达水平均高于各自对照组，差异有统计学意义（P0.05）。结论Thl7细胞在小鼠原位肝癌模型中数量增多，IL-17表达升髙，增强免疫反应，但在肝癌免疫中的作用及机制复杂，有待深入研究。［关键词］肝癌模型；Thl7细胞；IL-17；RORyT［中图分类号］R735.7［文献标识码］A［文章编号］1673-9701（2013）35-0005-03肝细胞癌（hepatocellutarcarcinoma,HCC）是世界上最多见的五大恶性肿瘤之一，死亡率列前三位［1］,我国是HCC多发国家。但目前以手术为主的综合治疗方法疗效仍不理想
3、，故近年来免疫治疗越来越受到重视。Thl7细胞是一种以分泌IL-17为主要特征的CD4+T细胞，孤核受体RORYT是其特异的转录因子。Thl7细胞首先是在EAE和CIA的研究中被发现，现研究表明IL-17的表达和人类很多自身免疫性疾病有关，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎症性肠病等[2-4]o最近研究发现，在一些肿瘤患者或小鼠肿瘤模型的肿瘤标本中Thl7细胞明显升高,但是关于Thl7和HCC的研究，国内鲜有见到相关的报道。故本研究通过建立Balb/C小鼠原位荷瘤模型，检测脾脏中Thl7细胞的比例、肿瘤微环境中IL-17基因和RO
4、RVT基因的表达，为能进一步系统地研究Thl7细胞在肝癌免疫中的作用和机制打下良好的基础。1材料与方法1.1材料1.1.1动物：6〜8周龄SPF级雄性Balb/C小鼠，体重(20±2)go30只小鼠随机分为肝癌模型组、生理盐水对照组、空白对照组，各10只进行实验。1.1.2肿瘤细胞株鼠源性H22腹水型肝癌细胞株。1.1.3抗体和试剂FITCRatAnti-MouseCD4、PERatAnti-MouseIL-17A购自美国BD公司；SYBRGreenSupermix购自美国Bio-rad,PCR引物由上海浦生生物科技有限公司合成。1
5、.2方法1.2.1小鼠原位肝癌模型的建立H22肝癌细胞注入Balb/C小鼠腹腔，后抽取癌性腹水调整细胞浓度备用。肝癌模型组：小鼠麻醉后，开腹直视下将0.01niL癌细胞悬液注入肝脏。生理盐水对照组：肝内注入0.01mL生理盐水。模型制作后第30天处死小鼠取肝脏肿瘤组织固定，常规HE染色，进行病理组织学诊断。1.2.2Th17细胞流式检测①取肝癌模型组、生理盐水对照组、空白对照组脾脏，机械法分离细胞，红细胞裂解液去除红细胞。②获得的各组脾脏单个核细胞按照免疫磁珠操作规程分选CD4+T细胞。③CD4+T细胞接种于24孔培养板，加入PMA
6、,Ionomycin,Monensin,使其终浓度分别为125ng/mL,1ug/mL和1。6Ug/mL,在37°C、5%二氧化碳的环境下培养4h。④取细胞悬液，先后加入CD3-PE-CY5,FITCRatanti-mouseCD4标记细胞表面抗原，PERatAnti-MouseIL-17A胞内染色，设同型对照组。用FACSCalibur流式细胞仪检测，以CD4,IL-17A双阳性细胞占CD4+T细胞的百分比记录结果。1.2.3实时荧光定量PCR检测Trizol法提取各组总RNA,反转录合成cDNAo由SYBRGreenSuperm
7、ix,forwardprimer,reverseprimer,cDNA等试剂建立一个10uL的反应体系（引物设计见表1）,放入ABI高通量荧光定量PCR仪7900HT进行反应，反应条件：开始50°C2min,95°C10min,接着95°C15s和60°C1min共45个循环。最后根据待测基因和内参的循环数CT值，使用2-AACT方法进行相对定量结果分析。1.3统计学方法采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计量资料以均数土标准差(x±s)表示，多组间比较均采用单因素方差分析,P0.05),见表2和图2o2.3IL-17基因和RO
8、RyT基因表达检测结果2.3.1肝癌模型组肿瘤组织IL-17mRNA的表达其水平(3.70±0.43)高于空白对照组肝脏组织(0.79土0.13),生理盐水对照组肝脏组织(0.84±0.39)和肝癌模型组癌旁远端组织(0.70±0.2
