实验中细胞铺板的方法.docx

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1、于侵袭、迁移等试验的细胞计数及铺板[实验步骤]1、准备工作用75%的酒精擦拭双手,同时用酒精棉球擦拭超净台。2)将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌(血清、培养基除外)3)倒置显微镜下,观察细胞的状态,是否已经长满培养瓶,需要进行分瓶。2、弃去培养基,用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlPBS液清洗一遍,四个方向晃动倒掉。3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿内,拍皿,上下左右铺匀,37°消化30分钟左右,随时观察,见到细胞泥沙状留下时,即消化完全.4、加入4ml的含5%血清的新鲜培养基,反复吹打消化好的细胞使其脱壁并

2、分散,制成细胞悬液,然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min.5、弃上清。用PBS3ml洗细胞,吹打或涡旋混匀,洗2次,离心1000rpm,3min.弃上清。6、配细胞稀释液(BSA终浓度为0.1%)每种细胞需3ml稀释液,共6个样品,所以配20ml稀释液(无血培20ml+10%BSA200ul.)7、细胞沉淀中加3ml细胞稀释液,吹打混匀,即得稀释过的细胞悬液。8、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品计数2次,算均值。(8个大格总数/8=数值*104)9、根据铺板密度,计算稀释过的细胞悬液用量,剩余体积用细胞

3、稀释液补。普通的细胞计数及铺板(免疫荧光,WB等不需定量)[实验步骤]1、准备工作用75%的酒精擦拭双手,同时用酒精棉球擦拭超净台。2)将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌(血清、培养基除外)3)倒置显微镜下,观察细胞的状态,是否已经长满培养瓶,需要进行分瓶。2、弃去培养基,用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlPBS液清洗一遍,四个方向晃动倒掉。3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿内,拍皿,上下左右铺匀,37°消化30分钟左右,随时观察,见到细胞泥沙状留下时,即消化完全.4、加入4ml的含血清的新鲜培养基,反复吹打消

4、化好的细胞使其脱壁并分散,制成细胞悬液,然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min.若细胞较多,则需稀释。5、取上述1ml细胞悬液,在加1ml含血清的新鲜培养基,混匀。6、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品对角线计数2次,算均值。7、根据铺板密度,计算稀释过的细胞悬液用量,剩余体积用含血清的新鲜培养基补。注意:1.不健康的细胞质中有空泡,细胞内有颗粒样物质,细胞间空隙增大,变形,不规则,失去原有的特点。2.是否污染:传代或换液24-48h注意观察细胞是否被污染,污染的细胞培养液变浑浊,镜下可见有大量菌丝。如果细

5、胞生长缓慢,生长特性改变,胞质内颗粒性物质增多,尽管培养液不变浑浊,考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走,以免污染其它细胞。3.皿用20天左右,可更换。4.分清无血培、血培的用途。二、Transwell检测肿瘤细胞迁移实验1.在板孔(下室)中加入600ul/well含有10%血清培养基作为引诱剂,小室底部接触培养基。2.轻轻的在细胞小室的上层加入140ul/well细胞悬液(若细胞密度为5x105cell/ml,则上室中共加入5x105cell/mlx140ul=7x104cell)。37°C孵育24小时(孵

6、育时间根据实验调整,12-36小时)3.孵育结束,小心取出细胞小室,用棉签轻轻擦去上室液体。移到预先加入800ul/well4%多聚甲醛或70%甲醇的下室中,室温固定30分钟。4.小心取出细胞小室,用吸干上室固定液。(可4°保存,隔日再做。)800ul/wellPBS加入下室洗3次。室温晾干。5.800ul/well0.1%结晶紫染色30min。6.迅速将小室浸没到ddH2O浸泡数次,去除多余的染料。吸去上室多余液体完全干燥小室。7.显微镜下观察结果,随机选取3个不同的视野拍照。8.

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