波形蛋白介导猪繁殖与呼吸综合征病毒感染.docx

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1、波形蛋白介导猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Ｍａｒｃ－１４５细胞作用的初步研究摘要：为了研究波形蛋白在介导ＰＲＲＳＶ感染过程中的作用，根据ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的波形蛋白序列，设计特异性引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从Ｍａｒｃ－１４５细胞中扩增目的基因，克隆入ｐＥＴ－２８ａ，转化表达菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行诱导表达，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ鉴定表达产物，将表达产物纯化后免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠制备血清，用病毒阻断实验验证ＰＲＲＳＶ与波形蛋白及其抗体的关系。用ＥＬＩＳＡ方法确定了重组波形蛋白与ＰＲ

2、ＲＳＶ结构蛋白Ｎ蛋白和囊膜蛋白ＧＰ５蛋白之间的关系。结果表明，成功的从Ｍａｒｃ－１４５细胞中扩增出全长的波形蛋白基因，将其克隆入ｐＥＴ－２８ａ，诱导后得到高效表达，表达蛋白纯化后免疫小鼠抗体效价达到１０５，病毒阻断实验表明波形蛋白能部分阻断ＰＲＲＳＶ感染，其抗血清能完全阻断ＰＲＲＳＶ感染。ＥＬＩＳＡ结果表明波形蛋白能与Ｎ蛋白结合而不与ＧＰ５蛋白结合。此结果为ＰＲＲＳＶ感染的细胞的受体机制增添了新的内容，为ＰＲＲＳＶ感染过程中受体间的相互作用关系研究奠定基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；波形蛋白；表达

3、；病毒阻断；Ｎ蛋白猪繁殖与呼吸综合征（Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ）是由ＰＲＲＳ病毒（ＰＲＲＳＶ）感染所致的一种急性传染病［１］，已成为危害世界养猪业的首要传染病。我国于１９９６年首次报道［２］，自２００６年以来出现了一种由高致病性ＰＲＲＳＶ引起的高致病性ＰＲＲＳ，以发病率和死亡率高、传播迅速为特征，在半年内几乎传遍了大半个中国［３－４］。ＰＲＲＳＶ的基因组含有９个相互重叠的开放读码框，编码７个结构蛋白［５］。ＧＰ５是ＰＲＲＳＶ的主要结

4、构蛋白，位于病毒囊膜上，含有４个糖基化位点，不仅可在体内诱导产生病毒中和抗体，而且在ＰＲＲＳＶ感染细胞的过程中起着重要的作用［６］Ｎ蛋白是ＰＲＲＳＶ基因组中保守性蛋白，其免疫原性最强，约占病毒粒子的２０％～４０％，是形成病毒核衣壳的基础，Ｎ蛋白含有２６％的碱性氨基酸，利于与病毒基因组ＲＮＡ相互作用［７－８］。波形蛋白作为细胞骨架中中间纤维的主要构成成分之一，对于细胞基本结构和生理活动起着重要的作用。波形蛋白具有组织特异性，不同类型细胞含有不同的波形蛋白，广泛存在于间充质细胞及中胚层来源的细胞中，能将细胞

5、核和细胞器维持在特定的空间。研究表明作为细胞基本生活构成元件之一的波形蛋白在疱疹病毒－１［９］、免疫缺陷病毒－１［１０］等多种病毒感染过程中起着重要作用，并且在不同的病毒感染过程中所起的作用不同。为了进一步研究波形蛋白与ＰＲＲＳＶ感染的关系，本实验从Ｍａｒｃ－１４５细胞扩增出波形蛋白基因，表达纯化后制备抗体，检测波形蛋白及其抗体对ＰＲＲＳＶ感染Ｍａｒｃ－１４５细胞影响，为ＰＲＲＳＶ感染过程中受体机制提供理论依据。材料与方法１　材料　Ｍａｒｃ－１４５细胞购自武汉细胞中心库，ＰＲＲＳＶ分离株ＴＡ－１２（Ｇｅ

6、ｎＢａｎｋ登录号：ＨＱ４１６７２０）由本实验室分离并保存。大肠杆菌ＤＨ５（、ＢＬ２１（DＥ３）及ｐＥＴ－２８ａ由本实验室制备并保存。ｐＭＤ１８－Ｔ载体购自ＴａＫａＲａ。Ｎ蛋白及抗Ｎ蛋白单克隆抗体、ＧＰ５蛋白及其抗血清由本实验室保存，ＰＲＲＳＶ阳性血清（效价：１：１００）由本实验室保存。２　试剂　Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ（ＡＭＶ）试剂盒，Ｔ４连接酶，限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ购自ＴａＫａＲａ；ＤＮＡ胶回收试剂盒、ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ为北京全式金公司产品；弗氏完全佐

7、剂、弗氏不完全佐剂、ＨＲＰ标记的山羊抗鼠ＩｇＧ、ＦＩＴＣ标记的山羊抗鼠ＩｇＧ购自Ｓｉｇｍａ公司；抗Ｈｉｓ单克隆抗体购于金斯瑞生物科技公司；增强型ＨＲＰ－ＤＡＢ显色液为北京天根生物技术公司产品。其余试剂均为进口或国产分析纯级试剂。３　引物设计与合成　根据ＧｅｎＢａｎｋ上发表的波形蛋白的基因序列（登录号：ＤＱ１９０９４９）设计并合成引物Ｆｖ１：５′－ＣＡＧＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧ－３′，Ｒｖ１：５′－ＡＡＧＧＴＣＡＡＧＡＣＧＴＧＣＣＡＧ－３′；Ｆｖ２：５′－ＡＡＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＴＧＴＴＧＧＴＴＣ

8、ＧＡＴＣＣ－３′（含ＥｃｏＲⅠ酶切位点）及Ｒｖ２：５′－ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＡＣ－３′（含ＨｉｎｄⅢ酶切位点）引物合成由上海生工生物有限公司完成。４　波形蛋白基因的扩增与鉴定　提取Ｍａｒｃ－１４５细胞总ＲＮＡ采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，以表Ｆｖ、Ｒｖ为引物扩增波形蛋白基因。按Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ（ＡＭＶ）试剂盒说明书配置反应缓冲液。反应在５０μｌ总体积中进行，以１μｇ总ＲＮＡ为模板，加入５Ｕ的ＡＭＶ