流式细胞检测细胞晚期凋亡原理与图解.doc

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1、流式检测细胞周期与晚期凋亡样品处理流程原理：在生物细胞中，DNA含量是恒定的参量，DNA含量随着细胞增殖周期各时期不同而发生变化，G0期细胞被认为是不参与细胞周期循环的一群细胞，即为静止细胞，其细胞为恒定的二倍体DNA含量，G1期细胞具有增殖活性，参与细胞周期循环，G1和G0期细胞DNA含量相同，均为二倍体，当细胞进入S期后，DNA含量逐渐增加，从二倍体到四倍体，一直到细胞DNA倍增结束，进入G2期，最终进入M期。荧光染料和细胞DNA分子可特异性结合，具有一定的量效关系：DNA含量与荧光染料的结合成正比，荧光脉冲与直方图通道值成正比根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。

2、这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性。由于核的改变造成各种荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变，细胞凋亡时，核酸内切酶激活，导致DNA广泛断裂，这是细胞凋亡的特征性表现，由于细胞膜的通透性增加和固定剂的影响，使DNA不能完全封闭在细胞中，凋亡细胞DNA含量减少，DNA直方图上显示在G1期前面出现一个DNA含量减少的亚二倍体峰，又称凋亡峰！样品处理：1.胰蛋白酶消化法收集处理好的细胞，做成单细胞悬液2.1000r/min离心5min，收集沉淀。3.沉淀用PBS洗2次，1000r/min离心5min，收集沉淀。4.细胞沉淀用4℃

3、预冷的70%的冰乙醇（预冷的70%酒精）1ml重悬，4℃过夜。即可送检。5.3000r/min离心1min离心去除固定液，用PBS洗2次，加入300ul-500ulPI与RNA酶混合液（PI50ug/ml，RNA酶10ug/ml）6.将细胞沉淀弹散，放入37℃温箱中，孵育30min7.上机检测8.结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧

4、光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。图解：