诺如病毒急性胃肠炎暴发的实验室检测.doc

《诺如病毒急性胃肠炎暴发的实验室检测.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、诺如病毒急性胃肠炎暴发的实验室检测确定一起学校急性胃肠炎暴发原因。方法采集病例粪便标本，直饮水标本，采用实时荧光定量（Real-time）PCR和RT-PCR方法检测病毒核酸，阳性标本测序分析。结果5份粪便标本中3份呈诺如病毒阳性，2份直饮水标本均呈诺如病毒阳性。3份病例粪便标本病毒株核苷酸序列一致，均为GⅡ-4型，提示病毒同源。结论对诺如病毒进行核酸检测，证实该疫情为一起诺如病毒GⅡ-4型引起的急性胃肠炎暴发。诺如病毒（NoV）被认为是目前引起急性病毒性胃肠炎暴发的重要原因之一，常在医院、餐馆、学校、托儿所、孤儿院、养老院、军队、家庭及其

2、他人群中引起急性胃肠炎的暴发[1]。近年在我国由该病毒引起的急性胃肠炎暴发的报道越来越多[2-6]。广州市某中学于2009-12发生一起急性胃肠炎疫情，病例的主要临床症状表现为呕吐伴恶心、腹痛、腹泻等胃肠道症状，个别病例还伴有发热症状。应用实时荧光定量（real-time）PCR和常规RT-PCR对该起疫情进行诺如病毒核酸检测，证实该起疫情是由诺如病毒GⅡ型引起的，结果报告如下。1对象与方法1.1基本情况该校共有学生1515人，教职员工123人，只设立高中部，全校有3个年级，共32个班级。学生以住宿生为主，共有宿舍120间，住宿学生1200

3、人。该校设有1个饭堂，提供校内学生及教职员工午、晚餐，该饭堂为B级单位，功能区域设置较为合理，饭堂共有16名员工，均已领取健康证。1.2疫情流行病学特征首发病例为女性，于2009-12-22出现恶心、呕吐及上腹部不适感，呕吐为非喷射性，呕吐物为胃内容物，无发热、腹泻及呼吸、循环系统症状，之后高三级其他班级又陆续出现多名腹泻病例，12月25日后无新增病例。该校共出现呕吐、腹泻病例55例，均为学生病例，罹患率为（55/1638）3.36%。发病高峰为12月23-24日，期间共发生病例47例，占发病总数的85.45%。病例主要集中在高三年级，共发

4、生病例53例，占发病总数的96.4%，呈现出一定的区域聚集性.该起疫情腹泻病人发病年龄集中在17~18岁,男性27例，罹患率为3.17%，女性28例，罹患率为3.57%。男女发病之比为1：1。临床症状主要以呕吐、腹泻为主，呕吐为非喷射性呕吐，平均2～3次，个别病例发病呕吐7次，呕吐物为胃内容物，腹泻为黄色水样便，平均1～2次/d，个别伴发热及腹痛症状。55名病例经就诊或居家治疗后症状缓解，无重症及死亡病例。1.3标本采集由于大部分学生发病后离校回家进行居家治疗，采集5份仍在校学生病例粪便标本及2份直饮水标本，水标本采集量分别为500ml，所

5、采集的标本于4℃保存送检。1.4标本检测1.4.1标本前处理①粪便标本：挑取粪便标本于EP管内，加1ml生理盐水，经漩涡振荡2min后制成10%便悬液，6000r/min离心5min，取上清提取病毒RNA。②水标本：用PEG-NaCl法进行浓缩[7]。将样品加入至等体积的16%的PEG8000,0.525MNaCl溶液中，充分混匀后，于4℃下静置过夜；次日在4℃10000r/min离心10min后弃上清液，沉淀溶解提取病毒RNA。1.4.2病毒RNA提取及检测提取病毒RNA采用QIAGENQIAampViralRNAMiniKit试剂盒，常

6、规RT-PCR采用日本TaKaRa公司的OneStepRNAPCRKit试剂盒，引物为P289（5’-TGACGATTTCATCATCMCCRTA-3’），P290（5’GATTACTCCAGGTGGGAYTCMAC-3’），目的片段长度为319bp[1]。实时荧光定量（real-time）PCR采用华银公司的Norovirus试剂盒。1.4.3核酸测序选取PCR阳性标本，送Invitrogen公司用PCR引物进行测序。测序结果经BLAST基因库比对后，应用MEGA4.0软件进行核苷酸序列同源性比较和种系进化分析，病毒参考株基因序列均来源于

7、GenBank:U07611(Hawaii/1971/US),AY134748(SnowMountain/1976/US),U22498(Mexico/1989/MX),X86775(Lordsdale/1993/UK),AF397156(MOH/99/HUN),AB039776(SaitamaU3/JP),AJ277608(Leeds/2000/UK),AB039780(SaitamaU25/JP)。2结果2.1病毒核酸检测5份粪便标本中3份及2份直饮水标本均为诺如病毒阳性，常规RT-PCR和实时荧光定量（real-time）PCR检测结

8、果一致，其中2份直饮水标本用实时荧光定量（real-time）PCR检测，绘制标准曲线，其病毒拷贝数为1×103个拷贝。2.2测序分析2份水标本由于RT-PCR产物量偏低不适合测