实验方案设计.docx

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1、实验方案设计1.仪器设备：超净工作台,超声波清洗器,漩涡振荡器,CP224S电子秤量仪,隔水式恒温箱,Q/CYAB10-2001手提式压力蒸汽灭菌锅,电冰箱,蒸汽消毒器,PH计:PH_3C,培养皿,试管,牛津杯，电炉等试管,三角烧瓶,烧杯,量筒,玻璃棒,培养基分装器,扭力天平,牛角匙,高压蒸汽灭菌锅,pH试纸（pH5．5—9．0）,棉花,牛皮纸,记号笔,麻绳,纱布等。2.实验方案3.1培养基的制备MRS培养基液体培养基：蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母膏5g,柠檬酸二铵2g,乙酸钠5g,磷酸氢二钾2g,硫酸镁.7H2O0.58g,硫酸锰0.25g,吐温-801ml,蒸馏水10

2、00ml,PH6.2-6.4.,琼脂18g,葡萄糖20g.LB培养基：蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g/l3.2试验方法3.2.1乳酸菌发酵上清液的制备将活化好的菌株以2%的接种量接种于MRS培养基中,37℃下培养24小时后,离心（4℃,6000r/min,15min）取发酵上清通过直径为0.22纳米的威龙滤菌器过滤,取过滤后的上清液,置于4℃的冰箱中保存并使用.3.2.2指示菌悬浊液的制备将活化后的指示菌培养液接种于LB培养基的试管中,培养24小时后得到菌悬液待用.先配置100ml生理盐水，加入250ml三角瓶中，再在其中加入20粒左右玻璃珠，高压灭菌，然后用接种

3、环将斜面上的菌苔刮下，接入三角瓶中，一般接1-2环接可，或者用少量的无菌生理盐水倒入斜面中，用接种环将菌苔刮下，然后倒入三角瓶中，将三角瓶震摇1分钟左右，即可生成菌悬液。3.2.3抑菌物质的理化特性（1）不同热处理对菌株所产抑菌物质抑菌活性的影响分别在不同的温度（45℃,60℃,80℃,100℃）下将菌株发酵上清液处理10min,大肠杆菌为指示菌进行抑菌试验,未经处理的发酵液作对照.1)倒平板：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿15ml（下层），待其凝固。此外，将融化的LB培养基冷却到50℃左右混入试验菌，将混有菌的培养基5ml加到已凝固的培养基上待

4、凝固（上层）。1)摆放牛津杯：以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯（内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。2)温度处理:分别在不同的温度（45℃,60℃,80℃,100℃）下将菌株发酵上清液处理10min）。3)加入待捡药业：在杯中加入待检样品（发酵液），牛津杯一般可以装240微升,勿使其外溢。4)培养：加满后置37℃培养16-18小时。5)结果报告：观察结果，抑菌圈用尺直接量就可以。不同ｐＨ值对菌株产抑菌物质抑菌活性的影响1)分别用1mol／LHCI和2mol／LNaOH将菌株发酵上清液

5、调至不同的ｐＨ值（3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0）,并以大肠杆菌作指示菌进行抑菌的试验,从未接种的MRS液体培养基调节至上述相应的PＨ值作对照.2)倒平板：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿15ml（下层），待其凝固。此外，将融化的LB培养基冷却到50℃左右混入试验菌，将混有菌的培养基5ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。3)摆放牛津杯：以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯（内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。4)PH处理:分别用1mol／L

6、HCI和2mol／LNaOH将菌株发酵上清液调至不同的ｐＨ值（3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0）5)加入待捡药业：在杯中加入待检样品（发酵液），牛津杯一般可以装240微升,勿使其外溢。6)培养：加满后置37℃培养16-18小时。7)结果报告：观察结果，抑菌圈用尺直接量就可以。(一)蛋白酶处理对发酵上清液抑菌物质的影响分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶，分别在它们最适pH（2.0，7.6），用浓度为100µg/mL的酶液在37℃处理1h，之后100℃水浴1min灭活，处理后将pH调到起点值再测定抑菌能力。1)倒平板：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内

7、，每皿15ml（下层），待其凝固。此外，将融化的LB培养基冷却到50℃左右混入试验菌，将混有菌的培养基5ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。2)摆放牛津杯：以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯（内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。3)蛋白酶处理:分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶，分别在它们最适pH（2.0，7.6），用浓度为100µg/mL的酶液在37℃处理1h，之后100℃水浴1min灭活。4)加入待捡药业：在杯中加入待