DB22∕T 2691-2017 明胶中貉源性成分定性检测 实时荧光PCR法.pdf

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1、ICS65.020.30B43备案号：56304-2017DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2691—2017明胶中貉源性成分定性检测实时荧光PCR法本标准仅供内部使用不得翻印IdentificationofRaccoonDogderivedmaterialsingelatin-RealtimePCRmethod2017-09-30发布2017-11-30实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2691—2017本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-2009和

2、GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中华人民共和国吉林市出入境检验检疫局，虎林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘金华，王岸英，刘婧，聂丹丹，罗雁非，王玮琳，曲辉，吴鑫本。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/2691—2017本标准仅供内部使用不得翻印明胶中貉源性成分定性检测实时荧光PCR法警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的

3、安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测方法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步骤、试验数据处理。本标准适用于明胶中貉源性成分的实时荧光PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB6783食品安全国家标准食品添加剂明胶本标准仅供内部使用不得翻印GB/T14699.1饲料采样

4、GB/T25165明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法3原理利用实时荧光PCR技术，根据貉物种的特异性基因序列对貉源性成分进行鉴定。利用裂解液破碎细胞，用酚、三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行内参照基因的实时荧光PCR检测，以确定样品DNA的提取效率；通过特异性引物和标记荧光物质的探针进行貉源性成分的实时荧光PCR扩增，根据对PCR扩增反应中荧光信号生成扩增曲线的判定，实现对貉源性成分的定性分析。4试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求。4.1裂解液:2%C

5、TAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)；100mmol/LTris(trishydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷)；1.4mol/LNaCl；20mmol/LEDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)，用HCl调至pH8.0。4.22×Real-timePCR预混液。4.3酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v/v）。4.4氯仿。4.5异戊醇。4.6无水乙醇。1DB22/2691—20174.7异丙醇。4.870%乙醇。4.9哺乳

6、动物特异基因（内参基因）引物和探针本标准仅供内部使用不得翻印哺乳动物特异基因上游引物：5’-AGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATG-3’哺乳动物特异基因下游引物：5’-TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3’哺乳动物特异基因探针：5’-（FAM）-CGCACACACCGCCCGTCACCC-（TAMRA）-3’4.10貉特异基因用引物及探针貉特异基因上游引物：5’-CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC-3’貉特异基因下游引物：5’-GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA-3’貉特异基因探针：5’-（FAM

7、)-CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC-(TAMRA)-3’5仪器和设备5.1实时荧光PCR仪。5.2高速冷冻离心机(不少于12000r/min)。5.3涡旋混合器。5.4分析天平：感量0.01g。5.5微量移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，2μL～20μL，10μL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。5.6核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。本标准仅供内部使用不得翻印5.7恒温水浴箱或金属浴。6样品按照GB6783对食用明胶采样（5.4），按照GB/T14699.1对饲料明胶采样，将实验样品粉碎，充分

8、混匀后待用。7试验步骤7.1样品DNA提取按GB/T25165规定的方法对样品进