DB22∕T 2628-2017 鹅细小病毒检测 聚合酶链式反应(PCR)法.pdf

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1、ICS11.220B41备案号:56329-2017DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2628—2017鹅细小病毒检测聚合酶链式反应(PCR)法Detectionmethodofpolymerasechainreactionforgooseparvovirus本标准仅供内部使用不得翻印2017–06-12发布2017-08-12实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2628—2017本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本

2、标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位:吉林省畜牧兽医科学研究院、吉林省动物疾病预防控制中心、吉林省畜牧总站、吉林省牧业信息中心、梅河口市畜牧总站、榆树市动物卫生监督所。本标准主要起草人:邵洪泽、黄海楠、孙亮、董航、李昱洁、王楠、郭衍冰、毛文智、呼延含蓉、卢松岩、张涛、李桂华、陆秀娟。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2628—2017本标准仅供内部使用不得翻印鹅细小病毒检测聚合酶链式反应(PCR)法警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验,本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当

3、的安全和健康措施,并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了鹅细小病毒检测方法的操作步骤和结果判定。本标准适用于鹅细小病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫本标准仅供内部使用不得翻印3生物安全措施为了保护实验室人员的安全,应由具备资格的工作人员检测,所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定

4、执行。4防污染措施防止污染措施应符合GB/T27401的规定。实验室应根据实验要求分为相对独立的工作区域,避免不同工作区域内的设备、物品混用;每一个区域须有专用的仪器设备。5试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。5.1PCR反应试剂如下:——10×PCR扩增缓冲液,见附录A中A.1;——2U/μLTaqDNA聚合酶;——10mmol/LdNTPs;——灭菌ddH2O。5.2DNA提取试剂盒或DNA抽提试剂如下:1DB22/T2628—2017——TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA

5、,pH8.0),见附录A中A.2;——酚-氯仿-异戊醇(25/24/1V/V);——异丙醇;本标准仅供内部使用不得翻印——70%乙醇。5.3其他试剂——生理盐水;——1倍TAE电泳缓冲液,见附录A中A.3;——凝胶加样缓冲液,见附录A中A.4;——10mg/mL溴化乙锭(EB),见附录A中A.5,或其他DNA染料替代品;——1.5%琼脂糖凝胶,见附录A.6;——矿物油;——DNAmarker。5.4阳性对照鹅细小病毒DNA或含有VP3基因片段的质粒。5.5阴性对照灭菌ddH2O。5.6引物本标准仅供内部使用不得翻印PCR引物浓度与序列,预计扩增片段375bp,见表1。表1特异

6、性引物浓度及序列使用浓度引物引物序列pmol/μL上游引物5'-CCAAGCTACAACAACCACATCTAC-3'20下游引物5'-CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC-3'6仪器6.1普通PCR仪。6.2低温高速离心机(12000g以上)。6.3电泳槽。6.4电泳仪。6.5紫外线灯或紫外凝胶成像仪。6.6可调微量移液器(200μL~1000μL、20μL~200μL、2μL~20μL、0.5μL~10μL)。6.7Eppendorf管(1.5mL、0.5mL、0.2mL)。6.8枪头(200μL~1000μL、20μL~200μL、2μL~20μL、0.5

7、μL~10μL)。6.9水浴箱(室温~100℃)或微波炉。2DB22/T2628—20176.10冰箱(4℃和-20℃)。6.11生物安全柜。6.12本标准仅供内部使用不得翻印电子天平(d=1mg)。7操作步骤7.1样品采集及保存采取可疑病鹅或病死鹅的肝、脾等病料2g,加1倍灭菌双蒸水研磨成匀浆,-20℃,10min,70℃反复冻融3次。将匀浆液5000g离心30min,取上清液作为检测样品,-20℃保存备用。7.2DNA模板的制备使用试剂盒提取病毒DNA,或取0.5mL样品放入1.5mLEppendo

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