大豆MYBZ2转录因子与外源次级信号分子(NO与MeJA)对长春花毛状根长春质碱生物合成的分子调控机理研究.pdf

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1、SichuanAgriculturalUniversityDISSERTATl0NSubmittedinPartialFulfillmentRequirementforⅣ队STERDEGI迮ERegulationmechanismofcatharanthinebiosynthesispathwaytotheoVerexpressionofGmMYBZ2andnitricoxide／MeJAelicitationinCatharanthusroseushairyrootcultureBy：ZhouMei—LiangDirec

2、tedbyProf．ShaoJi—RongandProf．TangYi—XiongProfession：BiophysicsYaan，Sichan，P．R．China，625014October2009]附件一论文独创性声明一JIIEIEIIIIllIIIII51l一}Y1801363本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的

3、材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：关于论文使用授权的声明年f0A》婿本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名：年．f，。Al氏年／，p月／多日黟饥炉f炒四川农业大学硕士学位论文摘要长春花属于夹竹桃科长春花属，含有

4、130多种生物碱，其中绝大多数具有药理学功效。特别是双萜吲哚生物碱，如3’，4’anhydrovinblastine，vincristine和vinblastine等具有抗癌功效，这些抗癌成分都是由前体物质vindoline和catharanthine合成。尽管这些物质药效显著，但在植株中含量极低，只有十万分之几甚至百万分之几，因此市场上供不应求，价格昂贵。由于长春花吲哚生物碱合成机理的复杂性，使得几十年来一直未能成功实现工业化生产。因此，解析长春花吲哚生物碱合成的分子调控机理成为工业化生产的迫切需要。本实验通过利用野生型

5、发根农杆菌A4浸染长春花无菌叶片获得了9个毛状根系，PCR检测发现，这九个根系都整合了黜质粒左边界的RolAB基因，其中有五个根系整合了Ri质粒右边界的Ags基因。HPLC检测同时含有RolAB基因和Ags基因的根系中catharanthine含量，结果发现达到了O．38—0．56mg／gFW，而对照的天然植株根部中未检测到catharanthine含量。Real．timePCR相对定量分析TIAs途径相关基因表明，负调控转录因子基因Zctl、Zct2表达水平下降，正调控因子Orca2、Orca3表达水平上升，其它各个关键

6、酶基因似Sa、Tdc、Dxs、Dxr、Hds、Mecs、GlOh、Sis、Str、Sgd、Cpr)均上调表达。这表明了Ri质粒T．DNA区相关基因对TIAs合成途径相关基因进行了全局调控，从而提高了catharanthine含量。通过利用野生型发根农杆菌A4把从大豆品种‘中豆27”中分离克隆的R2R3．MYB转录因子GmMYBZ2(DQ902861)导入到长春花毛状根中，获得了36个Karl抗性根系，其中有26个根系GUS染色呈阳性，24个根系整合了RolAB基因，17个根系整合了Ags基因，28个根系整合了GmMYBZ2

7、基因。在这36个Kan抗性根系中，23个根系同时整合了GmMYBZ2基因、RoIAB基因，16个根系同时整合了GmMYBZ2基因、RolAB基因和Ags基因，从23个根系中选取6个根系用PCR．SouthernBlotting检测GmMYBZ2基因，结果均为阳性。HPLC检测这6个PCR．SouthernBlotting检测阳性根系中catharanthine含量，结果显示这些根系含量均在0．2·O．25mg／gFW之间。Real-timePCR相对定量分析TIA$途径相关基因表明，Cpr、PGGT-I、Tdc、Zctl、

8、P甜基因上调表达，其中上调幅度最大的是Zctl，而ASa、Orca3、Str三个基因的表达水平却明显下调。结果说明四川农业大学硕士学位论文GmMYBZ2基因通过对ASa、Orca3、跏、Zctl、Pal基因的调控来降低catharanthine含量。这些基因的下调表达可能与GmMYBZ2转录因子C端所特