铁摄取相关调控基因rstA与fur对禽病原性大肠杆菌和尿道致病性大肠杆菌毒力的影响.pdf

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1、铁摄取相关调控基因rstA与扣，对禽病原性大肠杆菌和尿道致病性大肠杆菌毒力的影响Rolesofironacquisition—relatedregulationgenesrstAand砌，invirulenca“APECandUPECnceoI，跖，ArE本文受国家自然科学基金(31272559，30972196，30771604，30471281)；长江学者与创新团队发展计划(PCSIRT0978)和江苏省高校优势学科建设项目(PAPD)资助研究生：叶正琴专业：预防兽医学导师：高崧教授扬州大学兽医学院2014年6月叶正琴：铁摄取相关调控基因rst．4与fur对APE

2、C和UPEC毒力的影响一1铁摄取相关调控基因rstA与．肛，对禽病原性大肠杆菌和尿道致病性大肠杆菌毒力的影响善究嘉；芝芝萋授删321导师：高崧教授。V264u摘要埃希氏大肠杆菌(Escher&hiacoli，E．coli)，俗称大肠杆菌，在恒温动物出生后数小时即可进入消化道后段定居繁殖，继而成为肠道内正常菌群。在特定环境中部分大肠杆菌可成为致病性大肠杆菌，主要经由肠道内和肠道外引起感染现象。禽致病性大肠杆菌(AvianpathogenicE．coli,APEC)和人的尿道病原性大肠杆菌(UropathogenicE．coli，UPEC)均属于肠道外致病性大肠杆菌。AP

3、EC可引起全身或局部的感染，该菌主要感染禽类；UPEC则可引起人的尿道感染。有研究表明这两种菌株存在部分相似的毒力因子，其中包括铁摄取系统，有人推断APEC和UPEC之间可能存在着非常密切的同源性关系，尚待进一步的细菌常利用双组份信号传导系统(Two—componentregulatorysystem，TCS)对外界刺激产生应答反应以增强对环境的适应能力，而RstA／RstB系统正是一种由外膜感受蛋白RstB与其相应的应答蛋白RstA所组成的双组份系统。其中rstA基因编码的RstA蛋白可参与铁摄取途径的调控。Fur(ferricacquisitionregulato

4、r)蛋白在铁摄取系统中也发挥着重要作用，研究表明该蛋白是一种负调控蛋白，可使细菌避免由于摄铁过量而产生“铁中毒”的现象，对于维持细胞内铁离子浓度的平衡具有重要作用。由此可见，RstA和Fur均在铁摄取途径中有着重要的调控作用。本研究以本室自行分离的APEC强毒株E058和UPEC强毒株U17为模式菌株，利用九Red同源重组技术，分别构建了舡r和rstA的单基因突变株E058Afur、E058ArsM、U17Afur、U17ArstA以及双基因缺失株E058AfurArsM和U17AfurArstA。同时将目的基因连同其自身启动子克隆至pMD一18SimpleT载体上，

5、通过电转化的方法将重组质粒转入到基因缺失株中筛选获得回复株。通过对突变株生物学特性的研究以及对动物致病性的评价来研究铁摄取调控基[]fur和rstA对APECE058和UPECU17致病性的影响，进而比较两者毒力因子的相似性，为进一步研究人的尿道感染(Urinarytractinfections，UTIs)以及禽大肠杆菌病的致病机制和防治措施提供依据。体外进行的各项试验结果显示，突变株与野生株相比并没有出现太大的差异，如生长2扬州I大学硕士学位论文曲线测定显示，在贫铁培养基中的生长情况与野生株无异，而在富铁环境中加，．缺失株的生长速度明显下降，RstA缺失后也对细菌的

6、生长速度有一定的影响但并不显著；血清杀菌试验结果显示，突变株与野生株在抗血清补体杀菌能力方面并没有明显差异；在巨噬细胞吞噬试验中，突变株与野生株相比在抗吞噬和胞内存活方面也没有出现太大差异，暗示其它毒力代偿机制可能发挥着作用。1日龄鸡致死性试验结果显示，rstA突变株毒力明显下降，而mr突变株毒力致弱不明显。35日龄SPF鸡动态分布试验结果显示，E058ArstA和U17hrstA的致病作用相对于野生株有明显的下降，在所有脏器中定植能力均表现显著下降，而E058Afur和U17Afur未见明显致弱；双基因缺失株E058AfurArstA和U17AfurArstA毒力较

7、单基因缺失株下降更为显著，表明危，．与rstA之间存在协同致病的作用。组织病理学研究表明，野生株在鸡的脏器中所造成的病变较rstA单基因缺失株和双基因缺失株更加明显，而加缺失株感染鸡的脏器病变程度与野生株相似。ArstA单突变株与AfurArstA双突变株致病力明显F降，而Afur单突变株致病力则没有明显变化。上述结果表明，参与铁摄取调控的双组份系统RstA／RstB中rstA基因与APEC和UPEC的致病力有较强的相关性，而介导铁摄取负调控作用的加r基因并不能独立地对其致病性产生显著的影响，但可能与rstA基因发挥协同致病的作用。突变株与亲本株在其