全血RNA提取步骤.doc

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1、Trizol法提取全血总RNA实验前准备：Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇（用RNase-Free水配制），RNase-Free水，柠檬酸钠抗凝管。1ml注射器，1.5、3mlEP管（DEPC处理过），大、中、小号枪头（DEPC处理）150~250ul全血加入10倍体积TRIzol（主要是异硫氰酸胍）（1.5ml~2.5ml），充分吹打混匀，室温静置5min（使核酸蛋白复合物完全分离）。每1毫升的TRIzol试剂加入200ul的氯仿（300ul~500ul），静置3min，离心12000g，4℃，15

2、min。将上层水相转移到1.5mlEP管中，加500ul的异丙醇，上下颠倒混匀10s，室温静置10min，离心12000g，4℃，10min，弃上清。加入1ml的75%乙醇，上下颠倒混匀10s，离心7500g，4℃，10min，弃上清。室温下干燥5-10min（充分干燥不好溶解），加入50ul的RNase-free-water充分溶解RNA。分光光度计测OD值。（取2μl进行电泳，其余-80℃保存？）#加入TRIzol后可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8

3、℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。▲分光光度计检测质量取出2ul定量，测量buffer:10mMTrisCl(pH7.8)。A260/A280=1.8~2.1，说明RNA质量可靠；A260/A280<1.8，说明有蛋白污染；A260/A280>2.1，说明RNA存在降解。▲电泳检测RNA电泳检测RNA完整性：配制1%的凝胶，上样，120V电泳20min，紫外灯下观察结

4、果，若能看到28S和18S两条带，且亮度约为2：1，说明RNA完整性较好。