耐冷菌Pseudomonas sp.W7产低温蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究.pdf

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1、中文摘要低温蛋白酶在低温条件下具有较高的催化活性，在食品、洗涤、化妆品、医药和环境生物治理中具有潜在的应用价值。本论文对实验室保存的耐冷菌Pseudomonassp．W7所产的低温蛋白酶进行分离纯化，并系统的研究了该低温蛋白酶的酶学性质，为后期低温蛋白酶的基因克隆和工业化应用奠定基础。本研究是以实验室保存的一株耐冷菌Pseudomonassp．W7为出发菌株，采用低温摇床20℃培养48h，发酵液经过12000r／mm离心后，经硫酸铵分步沉淀、透析、SephadexG100凝胶过滤层析进行分离纯化，所得到的蛋白经过电泳分析，其分子量约为50kDa。经过纯化后的蛋白酶比活力

2、由151．16U／mg提高到7386．17U／mg，纯化倍数为48．86倍，回收率达到11．40％。在获得纯化酶基础上，对低温蛋白酶的酶学性质进行了研究。该酶最适反应温度为37。C，在20．35。C范围内热稳定性较好，保持了80％以上的酶活性，当温度升高到55"C，热处理60min后，酶活力完全丧失；最适pH值为7．2，属于中性蛋白酶，在pH4．10范围内都具有较强的催化活性。金属离子对酶活性有一定的影响，Mn2+表现出显著的激活作用，而A矿、H92+S：I]Fe3+的抑制作用最强，抑制剂EDTA几乎使酶失去活性，根据以上特点初步判断该酶是金属蛋白酶。有机溶剂对蛋白酶活

3、性的影响小，在低浓度(1％)时只有丙三醇对蛋白酶活性表现出激活作用，当高浓度(10％)时异丙醇和异丁醇表现出一定的抑制作用；保护剂对纯化酶稳定性的保护作用各不相同，海藻酸钠适合对酶液进行长期保护，而钙离子适合对蛋白酶的短期保护作用。酶催化水解酪蛋白、牛血红蛋白、牛血清蛋白三种底物，测定Km值分别为0．23699／L和0．4184g／L，纯化酶对牛血清白蛋白没有水解作用，所以酪蛋白是其最适底物；改变反应温度，Km略微呈现上升的趋势，随着温度的升高，K咖也逐渐上升，但Keat／Km在IO。C、20"C、30*C、406C几乎一致，符合低温蛋白酶的特征。本实验还对低温蛋白酶水

4、解牛奶的能力进行了分析，结果表明37。C下纯化酶对牛删奶蛋白酶解效果比中温木瓜蛋白酶好，低温蛋白酶水解牛奶蛋白产生游离氨基酸关键词：低温蛋白酶；分离纯化；酶学性质：低温微生物AbstractThecold-adaptedproteasehasbeenwidelystudiedforitshighactivityinlowertemperatureaswellaspotentialhi【ghvaluesforapplicationonfood，detergence，cosmetics,medicineandenvkonmentbiotechnologygovemance．

5、Therefore，thecold-adaptedproteasehasarousedinterestedbyscientistsaroundtheworld．Inthispaper,thecold—adaptedproteasewhichisproducedbythepsychrotrophsPseudomonassp．W7preservedinthelaboratoryhasbeenextractedandpurified，andthenstudiedthecharacterizationsofpurifiedenzymesystematically．Itwillb

6、eafoundationforthestudyofitsgenedoneandfurtherindustrialapplication．ThestrainofpsychrotrophsPseudomonassp．W7wasculturedat20"Cfor48h，andthentheproteasewasextractedbyultrafiltration，ammoniumsulfatefracfionationanddialysis，SephadexG100gelfiltrationWasnextcarriedoutforproteasepurification．SD

7、S-PAGEanalysisrevealedaproteinbandofaround50．0kDa．Thespecificactivityreached7386．19U／mgandwhichwas48．86foldshigherthanthecrudefermentingliquorandtheyieldwasupto11．40％．Thecharacterizationsofpurifiedcold-adaptedproteaseWasconsequentlystudied．Theoptimaltemperatureofthecold—a