蛋白质一级结构（primary structure）地测定.ppt

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1、蛋白质一级结构（primarystructure）的测定蛋白质测序的发展简史自从1953年Sanger首次完成胰岛素的氨基酸顺序测定以来，目前已有很大改进。但是Sanger花费多年时间才基本搞清胰岛素的一级结构，现在由于方法改进及自动化分析仪器的产生，现在已有数百种蛋白质的氨基酸序列问世。氨基酸序列测定的基本步骤（化学方法）分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端和羧基末端为何种氨基酸把肽链水解成片段测定各肽段的氨基酸排列顺序综合运用多种水解法分析肽段中的氨基酸顺序测序前的准备工作要求：样品纯度：97%以上相对分子质量：允许误差在10%左右（一）多肽链的拆分几条多肽链借助

2、非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍或高浓度的盐处理，即可使寡聚蛋白质中的亚基。如果多肽链间通过共价键（S—S）连接在一起，可采用氧化剂或还原剂将其断裂。（二）测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。（三）二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防它重新被氧化。一、氨基酸组成蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定它们的

3、量，算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数。二、末端测定的具体方法化学法二硝基氟苯法（DNP法）二甲基氨基萘磺酰氯法（Dansyl-氯法）肼解法还原成氨基醇法酶解法亮氨酸氨肽酶法细胞外氨肽酶法羧肽酶A法羧肽酶B法羧肽酶C法二硝基氟苯法(Sanger法）2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成黄色二硝基苯衍生物（DNP-氨基酸）氨基肽酶法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个地向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-端残疾顺序C-末端之肼解法多肽与肼在无水条件下

4、加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。肼解过程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破坏而不易测出，C-末端的精氨酸转变为鸟氨酸羧肽酶法羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个地水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-端残疾顺序羧肽酶来源专一性CpA胰脏能释放除Pro、Arg、Lys外的所有的C-端氨基酸CpB胰脏主要水解C-端为Arg、Lys的肽键CpC植物或微生物相当广泛，几乎能释放C-端的所有氨基酸还原成氨基醇法多肽C-端氨基酸可被硼氢化锂（Li

5、BH4）还原成α-氨基醇，用层析法可以鉴定氨基酸种类。Sanger早期测定胰岛素C-末端氨基酸采用此法。三、水解肽链成肽段水解酶或化学试剂水解部位作用的氨基酸胰蛋白酶羧基侧赖氨酸、精氨酸胰凝乳蛋白酶羧基侧芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）溴化氰羧基侧甲硫氨酸水解后得到的肽段，可用离子层析或其他层析方法将其分离纯化。比如用双向电泳可以得到肽图，由此可知肽段的多少。四、Edman降解法测定肽段的氨基酸序列耦联：使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。水解：PT

6、C-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。萃取：将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。转化：萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。Edman降解法测序每次只能测定几十个氨基酸残基，所以要测定较大蛋白质的氨基酸序列，需要将其降解为一些肽段，经HPLC分离出各个肽段，然后再进行Edman降解测序。五、鉴定每个肽段氨基酸顺序ABCDE*ABCDE部分水解*A,*AB,*ABC,*ABCD,*

7、ABCDE完全水解*A,*A+B,……*A+B+C+D+EDNFB*A,*A+*B,……*A+*B*+*C+*D+*E肽段经过分离纯化后，即可进行氨基酸测序。但是获得数据之后，还不能得出整条多肽链的氨基酸排列顺序，因为尚不清楚这些片段在多肽链中的先后次序。一般需要用到多种水解法，并分析出各肽段的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中的氨基酸序列。六、确定肽段在多肽链中的次序利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基