基于SEF14菌毛的肠炎沙门氏菌特异性诊断方法的建立及应用.pdf

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1、基于SEF14菌毛的肠炎沙门氏茵特异性诊断方法的建立及应用EstablishmentandapplicationofthespecificdiagnosticmethodbasedonSEF14fimbriaeforSalmonellaenteritidis专业：微生物学研究生：段小丽导师：朱国强教授段小丽：基于SEFl4菌毛的肠炎沙门氏菌特异性诊断方法的建立及应用基于SEF14菌毛的肠炎沙门氏菌特异性诊断方法的建立及应用专业：微生物学研究生：段小丽导师：朱国强教授中文摘要沙门氏菌属于肠杆菌科细菌，由此类细菌引起的各种动物疾病称为沙门氏菌病。目前，沙门氏菌污染禽蛋肉产品

2、已成为严重的全球性食品安全问题，其主要病原为肠炎沙门氏菌。SEFl4菌毛特异性表达于肠炎沙门氏菌和都柏林沙门氏菌等D．群沙门氏菌中，而都柏林沙门氏菌属于偏嗜性沙门氏菌，临床感染较少。因此，本试验以SEFl4菌毛为研究对象，通过优化SEFl4菌毛表达条件和制备抗SEFl4菌毛的单克隆抗体，以期建立肠炎沙门氏菌特异性诊断方法，为临床诊断奠定基础。研究一：设计4种不同的方法表达SEFl4菌毛，通过匀浆抽提菌毛进行SDS．PAGE检测和透射电镜观察菌毛的表达，以期筛选出肠炎沙门氏菌SEFl4菌毛最优表达条件。结果显示方法4的表达条件最优，电镜下可观察到SEFl4菌毛，且同等条件

3、下的菌毛抽提量最多，即接种肠炎沙门氏菌标准株50336于TSB培养基中，25。C摇床培养24h，次日按1：100转接到新的TSB培养基中，20。C摇床培养24h，第三天按1：50转接到CFA(pH6．0)培养基中，37℃静置培养50．60h。按上述方法培养标准株50336，用抗SEFl4菌毛单克隆抗体和胶体金标记的羊抗小鼠IgG分别9呼育进行免疫电镜，结果显示在菌毛表面吸附有胶体金颗粒，进一步表明成功表达出SEFl4菌毛。此外，在SEFl4菌毛最优表达条件下，采用匀浆抽提法提取SEFl4菌毛蛋白，SDS．PAGE结果显示从肠炎沙门氏菌标准株50336中成功抽提出大小为1

4、4．3KD的蛋白，与相关报道一致，Western．blotting结果进一步表明上述蛋白抽提物能被抗SEFl4单克隆抗体识别，为SEFl4菌毛。研究二：将表达SEFl4菌毛的肠炎沙门氏菌标准株50336用甲醛灭活，免疫BALB／c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术，用匀浆抽提的SEFl4菌毛蛋白作为检测原进行间接ELISA筛选，得到3株分泌性能稳定的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为3E4、3E7和3H5，扬州火学硕士学位论文燃孵一腹水抗体效价分别为1：128000、1：64000、1：64000。Western．blotting特异性检测绪果显示3株单克隆抗体均能与匀浆抽提

5、的SEFl4菌毛蛋白、肠炎沙门氏菌标准株50336和都柏林沙门氏菌C79—84发生免疫反应，在14．3KD处出现特异性的条带，而与其他4株沙门氏菌和3株大肠杆菌均不发生反应，说明本试验得到的单克隆抗体具有良好的特异性。研究三：本试验利用制备的抗SEFl4菌毛单克隆抗体建立了一种肠炎沙门氏菌特异性诊断方法，即SEFl4蛋白介导的双抗体夹心间接ELISA方法(SEFl4一DASELISA)。该方法是将单克隆抗体作为捕获抗体包被酶标板，抗SEFl4菌毛的鸡血清样本为第二抗体；方阵滴定试验确定捕获抗体和SEFl4蛋白的最佳工作浓度分别为899／mL和299／mL。用建立的SEF

6、l4一DASELISA检测100份鸡血清样本，59份为阳性，与肠炎沙门氏菌特异性基因片段sdfl的PCR符合率达93％。本试验建立的方法特异性强，灵敏性高，可用于临床诊断，对肠炎沙门氏菌特异性检测有潜在的应用前景。关键词：肠炎沙门氏菌；SEFl4菌毛；单克隆抗体；SEFl4．DASELISA；段小丽：基于SEFl4菌毛的肠炎沙门氏菌特异性诊断方法的建立及应用坐EstablishmentandapplicationofthespecificdiagnosticmethodbasedonSEF14fimbriaeforS．enteritidisM．S．Candidate：D

7、uanXiaoliAdvisor：Prof．ZhuGuoqiangAbstractSalmonellae，amemberofthefamilyofEnterobacteriaceae，areamajorcauseoffoodbomeillnessthroughouttheworld．Thebacteriaaregenerallytransmittedtohumansthroughconsumptionofcontaminatedfoodofanimalorigin，mainlymeat，poultry,eggsandmilk，andthe