果蝇ECPW2的克隆、表达、纯化和初步晶体学分析以及DnaB,DnaC的克隆、表达、纯化和结构探究.pdf

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1、中圈绅誊艘求犬誊硕士学位论果蝇ECPW2的克隆、表达、纯化和初步晶体学分析以及DnaB、DnaC的克隆、表达、纯化和结构探究作者姓名：学科专业：导师姓名：完成时间：赵辉生物化学与分子生物学滕脉坤教授牛立文教授二。一二年九月文UniversityofScienceandTechnologyofChinaAdissertationforMaster，SdegreeCloning，Expressing，PurificationandPreliminaryCrystallographicAnalysisofDrosophilamelanoga

2、sterECPW2andCloning，Expressing，PurificationandtheStructuraIResearchofEcoilDnaBandDnaCAuthor’SName：HuiZhaospecialitV：-．，Supervisor：11●‘■1．’FlnlSnedtlme：StructuralBiologyProfiMaikunTengProfiLiwenNiuSep25th，2012中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除已特别加以标注和致

3、谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：：签字日期：a丛垒卫星盟中国科学技术大学学位论文授权使用声明作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：·学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论j文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。作者签名：击翘：签字日

4、期：j印也牟—址监—绡导师签签字日摘要摘要1．果蝇ECPW2克隆、表达、纯化以及初步晶体学分析真核生物翻译过程中需要许多蛋白质因子的参与和调节。果蝇蛋白ECP是一种含有翻译起始因子elF5C结构域的蛋白质，含有422个氨基酸残基，两个独立折叠的结构域：N端结构域属于经典亮氨酸拉链家族；C端结构域属于含有W2结构域的BZW家族。同源序列比对后，我们发现ECP的W2结构域与许多真核翻译起始因子序列有着较高的序列同源性。同源性较高的有：人源elF2Bepsilon亚基C端结构域，人源P97C端结构域，em4gamma亚基和eIF5。跟据文献

5、报道，ECP可以与酿酒酵母中核糖体相关蛋白dRPL5发生免疫共沉淀，且突变体有着相似的缺失表型。因此我们推测ECP参与了蛋白质的转录起始过程。ECPW2结构域的晶体结构有助于我们了解ECP在细胞内如何行使功能。我们从含有果蝇ECPeDNA的质粒中克隆了ECPW2结构域的CDS序列，构建了ECPW2-p28质粒，并将EcpW2-p28质粒转化到g．coliBL2l(DE3)中，经过IPTG诱导，重组蛋白ECPW2在E．coliBL21(DE3)可溶性表达，用Ni亲和柱进行初步纯化。随后对于Ni柱纯化的洗脱液进行浓缩、脱盐以及换盐等一系列

6、条件摸索，发现蛋白在buffer25mMTris-HCl，pH8．0，NaCl盐浓度大于40mM／L的条件下，蛋白质溶液可以稳定存在。通过阴离子交换层析纯化和Superdex200凝胶阻滞层析纯化，我们得到了高纯度的ECPW2蛋白。用悬滴气相扩散法经过初筛和梯度优化以及Addtive晶体优化条件摸索，我们得到了可以用做X-RAY衍射的ECPW2蛋白结晶体。X-Ray衍射数据分析表明晶体衍射分辨率可达到2．70A，完成了晶体衍射数据的收集，晶体空间群为J4，晶胞参数为a=b=81．05，O=57．44A。一个晶体学不对称单位有一个蛋白质

7、分子。ECPW2与人源翻译起始因子elF2epsilon亚基有24％的同源性，以人源翻译起始因子elF2BesilonsubunitC端结构域为结构模型，用Molrep程序运行分子置换求解相位但没有得到合适的解。我们考虑进一步进行硒代蛋白的纯化。目前已经可以得到纯度较高硒代蛋白，蛋白的晶体生长条件仍然在摸索中。2．E．ColiDnaB、DnaC克隆、表达、纯化和结构探究E．coli中，DnaB是最主要的负责解旋双链DNA(dsDNA)的酶之一，在复制起始阶段DnaB将双链DNA解旋成单链DNA(ssDNA)。在经典模型中，DnaA结合

8、在OriC附近一段被称作TATA盒的序列，TATA盒会自发轻度解旋。摘要随后DnaA招募了DnaB，在DnaC的协助下，DnaB结合到OriC上，伴随着结合的发生ATP水解DnaC解离。DnaB发挥5’一3’的解旋酶活性