酵母醌氧化还原酶Zta1和巯基氧化酶Erv1的结构与催化机理研究.pdf

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1、中国科学技术大学博士学位论又酵母醌氧化还原酶Ztal和巯基氧化酶Ervl的结构与催化机理研究作者姓名：学科专业：导师姓名：完成时间：郭鹏超生物化学与分子生物学周丛照教授陈宇星教授二O一二年五月一目U"．=rsihofS。。TechnologyofChinaUniversityotcienceandechnoloclvofhinaSAdissertationfordoctor’SdegreeStructuralinsightsintothecatalyticmechanismofyeastquinoneoxidor

2、edUCtaSeZtalandsulfhydryloxidaseErvlAuthor’SName：Peng—ChaoGuoSpeciality：BiochemistryandMolecularBiologySupervisor：Prof．Cong—ZhaoZhouProf．YuxingChenFinishedtime：May1吼，2012中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究

3、成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：签字日期：中国科学技术大学学位论文授权使用声明作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入《中国学位论文全文数据库》等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。口公开白

4、簇密(—L年)作者签名：：丕卫魈绫堇垒作者签名：缎魈堑题．签字日期：丝垡：竺《!』里导师签名：签字日期：狸!全：!』!Z翌摘要第一部分自然界中的醌主要以毒性化合物形式存在，它在细胞内聚集会产生一系列毒性效应。醌脱氢酶／氧化还原酶会保护细胞免受醌的损害。这些酶会将醌还原成氢醌，而后者会与葡萄糖醛酸或硫酸盐等化合物偶联并被排出，从而起到解毒作用。NADPH依赖的醌氧化还原酶(Quinoneoxidomductase，QORs，ECl．6．5．5)属于中链脱氢酶超家族(MDR)中不含金属离子的一类还原酶。QORs最早是

5、在豚鼠和骆驼的眼睛晶状体中发现的，所以称之为‘-crystallins。起初认为，‘-crystallin是催化单电子反应，以NADPH为辅基，将醌还原成生成半醌中间体。最近的研究认为，它也是催化双电子反应，直接将醌还原成氢醌。随着研究的深入，在很多物种中都发现了<-erystallin．1ike的QORs。到目前为止，大肠杆菌QOR、细菌性斑点性病菌DC3000QOR和人源<-crystallin的结构已经被解析。一4个不对称单位中含有两个分子，每个分子由催化结构域和辅酶结合结构域组成。虽然<-crystall

6、in-likeQOR的生化活性和三维结构已经被报道，但是其底物结合位点和催化机制并不清楚。酿酒酵母中的‘-crystallin．1ikeQOR被称为Ztal，它存在于细胞质和细胞核中。研究表明，Ztal与哺乳动物‘-crystallins一样均以邻位醌作为最适底物。我们解析了酿酒酵母醌氧化还原酶Ztal．apo(2．00A)和结合NADPH(1．59A)的晶体结构。Ztal形成稳定的同源二聚体，每个单体均由催化结构域和辅酶结合结构域组成，辅酶NADPH结合在两个结构域之间的沟槽中。结构比较发现，NADPH的结合促

7、使Ztal的三维结构发生了明显的诱导契合效应(inducefit)，即蛋白的两个结构域相互靠近，使得NADPH结合更紧密；同时促进了位于结构域之间沟槽一端的底物结合口袋的形成。通过计算机模拟、定点突变和酶活动力学等方法，我们确认了Ztal的底物结合位点和关键活性残基，为阐释醌氧化还原酶QORs的底物特异性提供了结构学基础。另外，通过进化上的多重序列比对和酶活分析，我们还发现位于底物结合口袋入口处的一个残基从低等生物的Arg突变为脊椎动物的Gly会引起醌氧化还原酶活性的提高。关键词：醌氧化还原酶，酿酒酵母，晶体结构

8、，底物结合位点，酶活动力学第二部分细胞中许多蛋白在成熟和发挥生理作用时，需要形成二硫键来帮助其折叠并维持结构的完整性。在真核细胞中二硫键的正确配对发生在两个地方，分别是内质网饵R)和线粒体的膜间隙(IMS)。IMS中有专一的二硫键传递体系，通过引入二硫键帮助富含半胱氨酸的底物蛋白正确折叠。这类底物蛋白是由核编码，并在胞质中翻译合成，包括Tims蛋白和铜离子转运蛋白Coxl