医学基础化学 可见分光光度法和紫外分光光度法.ppt

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1、第十三章可见分光光度法和紫外分光光度法VisibleSpectrophotometryandUltravioletSpectrophotometry第一节物质的吸收光谱一、物质对光的选择性吸收光照射某物质，物质能够吸收光，使原有的基态转为激发态，只有当分子的能量(h)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(E)相等时才能被吸收。M(基态)+hM*(激发态)物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。第一节物质的吸收光谱互补色光示意图第一节物质的吸收光谱二、物质的吸收光谱将不同波长的单色

2、光依次通过有色溶液，测量溶液的吸光度A(absorbance)。以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得吸收曲线，或称吸收光谱。吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收波长，用max表示。一般，max是定性鉴别物质的基础。不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正比，这是进行定量分析的依据。第一节物质的吸收光谱三(邻二氮菲)合铁(II)离子的吸收光谱图(absorptionspectrum)max=510nm不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正比。第二节分光光度法基本原理一、透光率(transmittance)和吸光

3、度(absorbance)入射光强度I0，吸收光强度Ia，透过光强度It，反射光强度为IrI0═Ia+It+Ir被测溶液和参比溶液的吸收池同样材料和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为I0═Ia+It第二节分光光度法基本原理一、透光率和吸光度透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率(transmittance)，用T表示透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。A愈大，溶液对光的吸收愈多。第二节分光光度法基本原理二、Lambert—Beer定律Lambert-Beer定律：A=bc溶液厚度b，单位cm；浓度c，单位molL

4、-1；摩尔吸光系数(molarabsorptivity)单位:Lmol-1cm-1若用质量浓度代替cA═ab质量吸光系数(apercentangeabsorptivity)单位:Lg-1cm-1a和可通过下式相互换算═aM第二节分光光度法基本原理透光率T与溶液浓度c(或液层厚度b)之间的关系也可以以指数函数关系来表示：-lgT═bcT═10-bc第二节分光光度法基本原理应用Lambert—Beer定律时，需注意以下几点：Lambert—Beer定律仅适用于单一波长的单色光。入射光的波长范围越宽，则测定结果越容易偏

5、离Lambert—Beer定律。吸收过程中各物质间无相互作用，但各物质的吸光度具有加和性。即A═Aa+Ab+Ac+入射光波长不同时，摩尔吸光系数也不同。摩尔吸光系数越大，溶液对入射光的吸收就越强，测定的灵敏度就越高。分光光度法仅适用于微量组分的测定。(或a)确定是在低浓度下测定吸光度A，通过计算求出。第二节分光光度法基本原理例13-1已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmolL-1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系

6、数及质量吸光系数a。第二节分光光度法基本原理解由Lambert—Beer定律可得已知c═0.15010-3molL-1，b═2.00cm，T═0.398代入第二节分光光度法基本原理例测试酶与腺苷酸(AMP)体系的吸光度如下：A(280nm)═0.46，A(260nm)═0.58试计算每一组分的浓度。已知：酶的(280nm)═2.96104Lmol-1cm-1(260nm)═1.52104Lmol-1cm-1AMP的(280nm)═2.4103Lmol-1cm-1(260nm)═1.5104Lmol-

7、1cm-1吸收池厚度为1.00cm。第二节分光光度法基本原理解设酶和AMP的浓度分别为y和z因吸收光的加和性为260nm0.58═1.521041.00y+1.51041.00z为280nm0.46═2.961041.00y+2.41031.00z解方程得：y═1.410-5（molL–1）z═2.510-5（molL-1）即酶的浓度为1.410-5molL–1，AMP的浓度为2.510-5molL-1。第三节可见分光光度法二、测定方法标准曲线法取系列浓度标准溶液，测定吸光度A，作吸光度A

8、对溶液浓度c的图，得过坐标原点的直线。在相同条件下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液度。维生素B12的标准曲线第三节可见分光光度法标准对照法预先配制一个与待测液浓度相接近的标准溶液(其浓度用cs表示)，测得其吸